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硫肽类抗生素(Thiopeptide)是一类富含元素硫，氨基酸残基被高度修饰的环肽类抗生素。它们大都拥有一个以三或四取代的吡啶为核心，由多个噻唑、()唑或噻哗啉等氮杂环及脱水氨基酸所构成的环肽中心。研究表明这类抗生素可以很好地抑制革兰氏阳性菌的生长，特别是其中的Nocathiacin I对PRSP(有青霉素抗性的肺炎链球菌)的MIC值达到0.001μg/mL，比万古霉素高出10-20倍，同时它还对VREF(有万古霉素抗性的粪肠球菌)具有良好的杀伤作用，MIC值为0.015μg/mL。但这类抗生素的水溶性问题限制了它们在人体上的进一步利用，所以我们希望从克隆Nocathiacin I的生物合成基因簇出发，通过对其生物合成机制的研究，来发展更具临床应用价值的新一代硫肽类抗生素。
我们首先利用黏粒pOJ446为载体，构建了Nocathiacin I产生菌Nocardiasp.WW-12651的基因组文库。然后根据与脱氧糖基生物合成相关的N，N-二甲基转移酶的保守性序列设计简并性引物，以Nocardia sp.WW-12651的总DNA为模板，通过PCR扩增克隆了其中可能的N,N-二甲基转移酶基因片段，并将该片段标记为探针进行基因组文库的筛选。经Southern杂交实验和限制性酶谱分析，得到的六个相互重叠的重组黏粒共包含了染色体上长约50kb的DNA区域，而可能的N,N-二甲基转移酶基因则位于5.2kb的SmaI片段上。
接下来我们对黏粒cDY446-2-47-C2和B3进行了人工亚克隆测序，一共测定了45.563 kb的基因序列。通过GCG和Blast search的分析，我们发现测定的序列中包含了44个开放阅读框，其中可能与Nocathiacin I生物合成相关的基因有37个：8个可能与Nocathiacin I大环骨架生物合成相关的基因，4个可能与吲哚酸侧链合成相关的基因，6个可能与糖基合成相关的基因，此外还有5个P450氧化还原后修饰酶基因，2个甲基转移酶基因，2个抗性基因，3个调节基因，3个未知功能的基因，以及4个与转录翻译有关的基因。
在此基础上，我们通过与同源蛋白氨基酸序列的比对推测了部分基因编码蛋白的可能的催化机理，并提出了Nocathiacin I可能的生物合成途径。首先前体氨基酸经依赖ATP的途径活化，然后在核糖体中逐步组装成聚肽链前体，再经过一系列酶的翻译后修饰形成最终的聚肽产物。而其吲哚酸侧链则可能是在ORF34、36的催化下，按照自由基机理经过一系列分子内重排得到的，然后由ORF32、33等催化吲哚酸侧链与大环骨架的连接。Nocathiacin I糖基部分的合成则类似于其他糖肽类天然产物中氨基脱氧糖的生物合成途径。以活化的葡萄糖为前体，经ORF20、19、18、21、17等酶的作用，依次经过脱水、还原、甲基化、氨基化等过程得到4-N，N-二甲基-2,4,6-脱氧己糖中间体，再由ORF13转移到Nocathiacin I的大环骨架上，完成整个分子的组装。
为了在体内进一步研究Nocathiacin I生物合成基因的功能，我们首先完成了Nocathiacin I的发酵、分离纯化和HPLC-MS检测，并构建了一系列用于基因中断和异源表达的质粒。通过对其生物合成基因的体内中断和整个生物合成基因簇的异源表达的大量尝试，我们发现Nocardia sp.WW-12651特殊的限制-修饰系统影响了中断质粒的进入和表达，而且表达载体pPAC-S2在异源宿主菌S.lividans ZX7中会引起Nocathiacin I生物合成基因簇的片段缺失。
随后我们在克隆Nosiheptide生物合成基因簇的基础上，对Nosiheptide的生物合成基因进行了详细的生物信息学分析，并通过与Nocathiacin I生物合成基因簇的对比，提出在Nosiheptide的体系中研究Nocathiacin I生物合成基因功能的设想。首先我们在构建与Nosiheptide大环骨架和吲哚酸侧链生物合成相关的5个基因同框敲除突变株的基础上，通过Nocathiacin I中对应基因的异源互补，证实了两者基因功能的一致性及大环骨架和吲哚酸侧链生物合成途径的相似性，并提出了其中可能的前体肽剪切顺序。然后我们通过对Nosiheptide生物合成基因簇中2个p450氧化还原酶基因Nos-orf5和Nos-orf6的同框敲除，初步证实了这两个基因的功能，并提出了其中可能的氧化还原后修饰顺序及伴随的竞争反应。我们又通过Nocathiacin I中对应基因的异源互补，证实了Nos-orf5和Noc-orf14、Nos-orf6和Noc-orf26功能的一致性。同时我们还构建了Nocathiacin I中独有的3个p450氧化还原酶基因Noc-orf23、22、25在Nosiheptide野生型菌株中异源表达的突变株，并通过对发酵产物的检测分析，初步证实了这三个基因的功能和可能的氧化还原后修饰位置。
总之，本文中我们克隆了首例硫肽类抗生素Nocathiacin I的生物合成基因簇，并证实其核糖体介导的生物合成机制，为今后研究其他硫肽家族抗生素的生物合成途径提供了思路。在此基础上我们还发展了一套快速克隆其他硫肽类抗生素生物合成基因簇的通用方法。同时通过对部分硫肽类抗生素生物合成基因体内功能的初步研究，为进一步在体外研究新型的酶催化反应及筛选更具临床应用价值的新型药物提供了可能。