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在以往的研究中,本课题组挑选具有细胞周期依赖性染色的自身免疫病人抗体进行Hela细胞cDNA文库筛选,鉴定出一个与经典细胞核有丝分裂器蛋白NuMA定位相似的细胞核微管结合蛋白CDCA4(celldivisioncycleassociated4)。CDCA4的定位随细胞周期发生特异性的变化:间期在核仁中富集,胞质中也有分布;分裂期迁移至中心体;后期除在纺锤体极有分布外,在中板位置也有定位;到分裂末期,则重新回到子细胞核中。利用RNAi技术降低CDCA4的表达量,多核、多中心体等异常细胞的比例显著增加。这些结果都表明CDCA4在调节细胞周期进程方面发挥着重要作用。此次研究的目的就在于,利用过表达技术,进一步分析CDCA4在细胞周期调控方面的作用。同时,通过寻找并鉴定CDCA4的相互作用蛋白,研究其在细胞内的具体生物学功能。
研究工作主要围绕以下四部分展开:
首先,筛选获得CDCA4的过表达稳定克隆细胞株后,过表达细胞出现了生长速度降低、G2/M期阻滞、多核、多中心体细胞比例增加等一系列异常现象。这些结果与RNAi结果相互吻合,表明CDCA4很有可能是一个抑制细胞增殖的调控因子。并且,与对照组相比,过表达细胞在形态上也发生了异常变化,梭形细胞减少,圆形细胞增多,贴壁细胞数降低,这些结果显示CDCA4.是细胞分裂过程中的重要调控因子。
另外,对体外表达的CDCA4进行纯化,并通过pulldown试验及质谱鉴定,成功寻找出一个CDCA4的互作候选蛋白IQGAP1(IQmotifcontainingGTPaseactivatingprotein1)。后续展开的免疫共沉淀试验也支持IQGAP1与CDCA4为一对相互作用蛋白这一结果。并且,在CDCA4过表达细胞株中,IQGAP1的表达量显著降低,表明CDCA4与IQGAP1在细胞内存在密切关系。
同时,利用FLAG标签抗体,通过免疫沉淀技术获得了一系列CDCA4的互作候选蛋白,但是这些蛋白与CDCA4在体内是否存在相互作用仍有待于进一步的试验验证。
最后,CDCA4的理论分子量为26KD,而WesternBlot显示其表观分子量为34KD,这极有可能是磷酸化等蛋白修饰的结果。本组利用双向电泳及WesternBlot试验,证实了CDCA4在体内多种修饰形式的存在。并通过对比中期及间期蛋白样品的WesternBlot结果,推测CDCA4的蛋白修饰随细胞周期进程而改变。