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目的：
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是一种糖尿病性微血管病变，是糖尿病中最常见、最重要的致盲病，其发病机制与高血糖诱导的氧化应激、多元醇途径、慢性炎症等有关。神经胶质成熟因子-beta(GMFB)是由脑组织提取得到的一种17kDa的酸性蛋白质，主要在中枢神经系统中星型胶质细胞和一些神经元表达。实验室前期研究发现，GMFB在糖尿病早期视网膜病变中起着重要作用。用25mM葡萄糖处理大鼠Muller细胞以及在Muller细胞中过表达GMFB，发现p-ERK的表达降低，而p-P38的表达升高，说明过表达GMFB会降低Muller细胞的增殖，增强细胞炎症反应。高糖环境会导致GMFB的高表达，而GMFB高表达又会引起ROS水平的升高、脂质过氧化、IL-33分泌增加以及引起细胞凋亡。本课题的主要目的是研究在糖尿病大鼠玻璃体腔内注射GMFB抗体和在大鼠体内完全敲除GMFB基因对早期糖尿病视网膜病变是否会有抵抗作用。
方法：
第一部分：玻璃体腔注射GMFB抗体对DR的干预作用
(1)以60mg/kg体重剂量腹腔注射链脲霉素(Streptozotocin,STZ)诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠形成糖尿病，诱导糖尿病成功的第二天，在糖尿病大鼠右眼注射GMFB抗体10μL，浓度：10μg/150μl，左眼内玻璃体腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)10μL作为对照。注射抗体的2周、3周、4周、6周收取眼球样本用于后续研究，包括：1、ERG检测视功能；2、WesternBlot检测GMFB、炎症因子、胶质纤维酸性蛋白(Glia fibrillary acidic protein, GFAP)在视网膜中蛋白水平表达；3、逆转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)检测GMFB、GFAP、IL-1β和IL-33在视网膜中mRNA水平表达；4、免疫荧光方法检测GMFB、GFAP在视网膜中的表达和位置。5、TUNEL检测视网膜细胞的凋亡情况。
第二部分：GMFB基因敲除对DR的抵抗作用
(2)用杂合敲除大鼠连续与野生型(Wild Type)SD大鼠交配三代以上稀释脱靶效应，得出纯合敲除大鼠。WesternBlot和免疫荧光验证敲除大鼠视网膜内是否确实无GMFB的表达。
(3)以60mg/kg体重剂量腹腔注射链脲霉素(Streptozotocin,STZ)诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠形成糖尿病，作为体内研究模型。把实验动物分为WT组和KO+1组，每一组内又分别分成对照组和糖尿病组。糖尿病建模1周、2周和4周收取眼球样本用于后续研究，包括：1、ERG检测视功能；2、WesternBlot检测GMFB、炎症因子、细胞胶质化标志物GFAP、Vimentin、凋亡信号蛋白在视网膜中蛋白水平表达；3、免疫荧光方法检测GFAP在视网膜中的表达和位置。
结果：
(1)在糖尿病大鼠眼球内注射GMFB抗体，2周时ERG结果显示与糖尿病大鼠相比，玻璃体腔内注射GMFB抗体的眼球b波值显著增高(P=0.0015)，说明GMFB抗体对视功能有保护作用，3周以后与对照组相比无显著差异。WesternBlot(P=0.0408)、Q-PCR(P=0.0452)和免疫荧光结果显示，玻璃体腔内注射GMFB抗体的眼球GFAP表达量显著下调，说明GMFB抗体减弱了神经细胞的胶质化。Q-PCR结果显示，玻璃体腔内注射GMFB抗体的眼球IL-33表达量显著下调(P=0.0288)，说明GMFB抗体对DR中的视网膜炎症有抵抗作用。TUNEL结果显示玻璃体腔内注射GMFB抗体的视网膜凋亡细胞显著减少(P=0.0405)，说明GMFB抗体对糖尿病视网膜中的细胞凋亡有抵抗作用。
(2)纯合敲除大鼠有三种基因型：1、GMFB基因序列的原有碱基中插入1个碱基A(KO+1)；2、GMFB基因序列的原有碱基中插入5个碱基AAAGT(KO+5);3、GMFB基因序列的碱基中敲除20个碱基AGATTTAGTGGAAAAGCTGA(KO-20)。碱基的破坏对繁殖和生育产生了影响，碱基破坏较少的KO+1与正常大鼠繁殖能力相当，得到了足够多的后代进行实验；KO+5的大鼠繁殖数目较KO+1略少，但尚可繁殖，目前没有得到足够数量的后代；KO-20这一基因型由于碱基缺失多，影响其生育，这一基因型没有交配出纯合的敲除后代。脱靶效应稀释后，得出可以稳定遗传的GMFB-KO+1大鼠，生命体征、健康状况和寿命与正常野生型大鼠无异，且WesternBlot和免疫荧光检测视网膜内无GMFB蛋白的表达。
(3)WT与KO大鼠同时用STZ诱导Ⅰ型糖尿病，与WT的STZ大鼠相比，糖尿病发病第2周，ERG结果显示KO+1大鼠的b波值显著高于WT大鼠(P=0.0469)，说明GMFB基因敲除在DR的早期发病过程中对视功能有保护作用。WesternBlot和免疫荧光结果显示，KO+1和WT大鼠相比，视网膜内GFAP表达量显著较低(P=0.0036)。与WT的STZ大鼠相比，KO+1大鼠糖尿病发病第1周(P=0.0104)、第2周(P=0.0002)和第4周(P=0.0281)视网膜内GFAP的表达量显著降低，且WT大鼠糖尿病发病1周时，视网膜内Vimentin的表达显著增强(P=0.0233)，而KO+1大鼠视网膜内则无此变化，说明GMFB基因敲除大鼠在DR的早期发病过程中有减弱视网膜胶质化的作用。WesternBlot结果显示，和WT大鼠相比，KO+1大鼠视网膜内p-NF-kB表达量显著较低(P=0.0331)。与WT的STZ大鼠相比，KO+1大鼠糖尿病发病第1周(P=0.0068)、第2周(P=0.0008)和第4周(P=0.0156)视网膜内p-NF-kB的表达量显著降低，说明GMFB基因敲除大鼠在DR的早期发病过程中有抵抗炎症的作用。WT大鼠糖尿病发病1周(P=0.0445)和4周(P=0.0258)时，视网膜内CHOP的表达显著增强，而KO+1大鼠视网膜内则无此变化，说明GMFB基因敲除大鼠在DR的早期发病过程中有抵抗视网膜细胞凋亡的作用。
结论：
玻璃体腔注射GMFB抗体在DR大鼠视网膜中抗胶质化和抗炎症及视网膜细胞的凋亡，提示GMFB抗体玻璃体腔注射在大鼠的早期糖尿病病程中对视网膜病变有保护作用。
GMFB-KO+1大鼠在生理状态、健康状况和寿命方面与正常野生型大鼠无异，用于后续实验。
在DR发病早期，GMFB基因敲除的大鼠有更强的视功能保护机制。在第1周、第2周和第4周时检测WT大鼠和KO大鼠的视网膜内相关蛋白，发现KO大鼠视网膜内GFAP(P=0.0036)、p-NF-kB(P=0.0331)表达显著较低。且随着糖尿病病程的延长，WT大鼠视网膜内Vimentin和CHOP表达增强，而KO大鼠视网膜内则无此变化。说明GMFB基因敲除的大鼠可以抵抗DR发病过程中的视网膜胶质化、炎症和凋亡。
糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是一种糖尿病性微血管病变，是糖尿病中最常见、最重要的致盲病，其发病机制与高血糖诱导的氧化应激、多元醇途径、慢性炎症等有关。神经胶质成熟因子-beta(GMFB)是由脑组织提取得到的一种17kDa的酸性蛋白质，主要在中枢神经系统中星型胶质细胞和一些神经元表达。实验室前期研究发现，GMFB在糖尿病早期视网膜病变中起着重要作用。用25mM葡萄糖处理大鼠Muller细胞以及在Muller细胞中过表达GMFB，发现p-ERK的表达降低，而p-P38的表达升高，说明过表达GMFB会降低Muller细胞的增殖，增强细胞炎症反应。高糖环境会导致GMFB的高表达，而GMFB高表达又会引起ROS水平的升高、脂质过氧化、IL-33分泌增加以及引起细胞凋亡。本课题的主要目的是研究在糖尿病大鼠玻璃体腔内注射GMFB抗体和在大鼠体内完全敲除GMFB基因对早期糖尿病视网膜病变是否会有抵抗作用。
方法：
第一部分：玻璃体腔注射GMFB抗体对DR的干预作用
(1)以60mg/kg体重剂量腹腔注射链脲霉素(Streptozotocin,STZ)诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠形成糖尿病，诱导糖尿病成功的第二天，在糖尿病大鼠右眼注射GMFB抗体10μL，浓度：10μg/150μl，左眼内玻璃体腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)10μL作为对照。注射抗体的2周、3周、4周、6周收取眼球样本用于后续研究，包括：1、ERG检测视功能；2、WesternBlot检测GMFB、炎症因子、胶质纤维酸性蛋白(Glia fibrillary acidic protein, GFAP)在视网膜中蛋白水平表达；3、逆转录PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)检测GMFB、GFAP、IL-1β和IL-33在视网膜中mRNA水平表达；4、免疫荧光方法检测GMFB、GFAP在视网膜中的表达和位置。5、TUNEL检测视网膜细胞的凋亡情况。
第二部分：GMFB基因敲除对DR的抵抗作用
(2)用杂合敲除大鼠连续与野生型(Wild Type)SD大鼠交配三代以上稀释脱靶效应，得出纯合敲除大鼠。WesternBlot和免疫荧光验证敲除大鼠视网膜内是否确实无GMFB的表达。
(3)以60mg/kg体重剂量腹腔注射链脲霉素(Streptozotocin,STZ)诱导Sprague-Dawley(SD)大鼠形成糖尿病，作为体内研究模型。把实验动物分为WT组和KO+1组，每一组内又分别分成对照组和糖尿病组。糖尿病建模1周、2周和4周收取眼球样本用于后续研究，包括：1、ERG检测视功能；2、WesternBlot检测GMFB、炎症因子、细胞胶质化标志物GFAP、Vimentin、凋亡信号蛋白在视网膜中蛋白水平表达；3、免疫荧光方法检测GFAP在视网膜中的表达和位置。
结果：
(1)在糖尿病大鼠眼球内注射GMFB抗体，2周时ERG结果显示与糖尿病大鼠相比，玻璃体腔内注射GMFB抗体的眼球b波值显著增高(P=0.0015)，说明GMFB抗体对视功能有保护作用，3周以后与对照组相比无显著差异。WesternBlot(P=0.0408)、Q-PCR(P=0.0452)和免疫荧光结果显示，玻璃体腔内注射GMFB抗体的眼球GFAP表达量显著下调，说明GMFB抗体减弱了神经细胞的胶质化。Q-PCR结果显示，玻璃体腔内注射GMFB抗体的眼球IL-33表达量显著下调(P=0.0288)，说明GMFB抗体对DR中的视网膜炎症有抵抗作用。TUNEL结果显示玻璃体腔内注射GMFB抗体的视网膜凋亡细胞显著减少(P=0.0405)，说明GMFB抗体对糖尿病视网膜中的细胞凋亡有抵抗作用。
(2)纯合敲除大鼠有三种基因型：1、GMFB基因序列的原有碱基中插入1个碱基A(KO+1)；2、GMFB基因序列的原有碱基中插入5个碱基AAAGT(KO+5);3、GMFB基因序列的碱基中敲除20个碱基AGATTTAGTGGAAAAGCTGA(KO-20)。碱基的破坏对繁殖和生育产生了影响，碱基破坏较少的KO+1与正常大鼠繁殖能力相当，得到了足够多的后代进行实验；KO+5的大鼠繁殖数目较KO+1略少，但尚可繁殖，目前没有得到足够数量的后代；KO-20这一基因型由于碱基缺失多，影响其生育，这一基因型没有交配出纯合的敲除后代。脱靶效应稀释后，得出可以稳定遗传的GMFB-KO+1大鼠，生命体征、健康状况和寿命与正常野生型大鼠无异，且WesternBlot和免疫荧光检测视网膜内无GMFB蛋白的表达。
(3)WT与KO大鼠同时用STZ诱导Ⅰ型糖尿病，与WT的STZ大鼠相比，糖尿病发病第2周，ERG结果显示KO+1大鼠的b波值显著高于WT大鼠(P=0.0469)，说明GMFB基因敲除在DR的早期发病过程中对视功能有保护作用。WesternBlot和免疫荧光结果显示，KO+1和WT大鼠相比，视网膜内GFAP表达量显著较低(P=0.0036)。与WT的STZ大鼠相比，KO+1大鼠糖尿病发病第1周(P=0.0104)、第2周(P=0.0002)和第4周(P=0.0281)视网膜内GFAP的表达量显著降低，且WT大鼠糖尿病发病1周时，视网膜内Vimentin的表达显著增强(P=0.0233)，而KO+1大鼠视网膜内则无此变化，说明GMFB基因敲除大鼠在DR的早期发病过程中有减弱视网膜胶质化的作用。WesternBlot结果显示，和WT大鼠相比，KO+1大鼠视网膜内p-NF-kB表达量显著较低(P=0.0331)。与WT的STZ大鼠相比，KO+1大鼠糖尿病发病第1周(P=0.0068)、第2周(P=0.0008)和第4周(P=0.0156)视网膜内p-NF-kB的表达量显著降低，说明GMFB基因敲除大鼠在DR的早期发病过程中有抵抗炎症的作用。WT大鼠糖尿病发病1周(P=0.0445)和4周(P=0.0258)时，视网膜内CHOP的表达显著增强，而KO+1大鼠视网膜内则无此变化，说明GMFB基因敲除大鼠在DR的早期发病过程中有抵抗视网膜细胞凋亡的作用。
结论：
玻璃体腔注射GMFB抗体在DR大鼠视网膜中抗胶质化和抗炎症及视网膜细胞的凋亡，提示GMFB抗体玻璃体腔注射在大鼠的早期糖尿病病程中对视网膜病变有保护作用。
GMFB-KO+1大鼠在生理状态、健康状况和寿命方面与正常野生型大鼠无异，用于后续实验。
在DR发病早期，GMFB基因敲除的大鼠有更强的视功能保护机制。在第1周、第2周和第4周时检测WT大鼠和KO大鼠的视网膜内相关蛋白，发现KO大鼠视网膜内GFAP(P=0.0036)、p-NF-kB(P=0.0331)表达显著较低。且随着糖尿病病程的延长，WT大鼠视网膜内Vimentin和CHOP表达增强，而KO大鼠视网膜内则无此变化。说明GMFB基因敲除的大鼠可以抵抗DR发病过程中的视网膜胶质化、炎症和凋亡。