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爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染与多种人类肿瘤发生密切相关。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)主要发生在我国南方及东南亚等地区，发病率可高达25-50/10万。NPC高发区约有95％的病例为未分化型非角质化癌，EBV可在约98％的非角质化NPC病例中检测到。因此NPC是EBV相关肿瘤免疫治疗策略开发的理想模型。NPC中表达的EBV核抗原1(EBV nuclear antigen 1，EBNA1)含有HLAⅠ类分子限制性CD4+T细胞表位，主要在CD4+T细胞免疫应答中起重要作用，而潜伏膜蛋白(Latent membrane protein 1，LMP1)是癌基因。潜伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2，LMP2)参与EBV在上皮细胞中的长期潜伏，主要功能是负调节B细胞受体信号。LMP2可在几乎所有非角质化NPC中检测到，且无致癌性。LMP2具有多个CD8+T细胞表位，能诱导有效的CD8+T细胞免疫应答。因此，LMP2被认为是NPC免疫疗法的理想靶标。
研究表明许多NPC患者体内仍具有一定程度的LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答，但未能控制疾病的发生。临床试验证实靶向EBV-LMP2疫苗直接免疫接种可在NPC患者体内增强LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答，并可在某些NPC患者中产生临床收益，但CTL应答与临床收益之间的相关性尚未阐明。目前，靶向EBV-LMP2免疫治疗策略亟需解决的难题是如何进一步提高患者的临床收益率。然而，靶向EBV-LMP2疫苗的研究尚主要集中于如何诱导强烈并持久的LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答，对于诱生的LMP2特异性CD8+T细胞介导的细胞毒作用及其机制的研究尚未见报道。此外，任何靶向EBV-LMP2疫苗开发所面临的重大挑战是疫苗诱生的LMP2特异性CD8+T细胞能否识别并杀死表达病毒逃逸蛋白LMP2的肿瘤细胞。因此，迫切需要阐明疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞介导的特异性细胞毒作用及其机制，并寻找有效的辅助治疗策略来增强NPC患者体内LMP2特异性CD8+T细胞的细胞毒性。这对于靶向EBV-LMP2疫苗的研究及其临床应用，并进一步提高NPC患者的临床反应率，是至关重要的。
本室前期研究中，构建了携带EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗，在动物试验中证明是安全的，可诱导LMP2特异性T细胞免疫应答，但并未对疫苗的免疫接种策略和疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞介导的细胞毒性进行深入研究。本研究的目的在于构建携带EBV-LMP2基因的复制缺陷型重组腺病毒疫苗rAd5-LMP2，并对其免疫原性进行深入研究;开发新型LMP2特异性CD8+T细胞免疫效果评价体系，从而对疫苗免疫诱导的LMP2特异性CD8+T细胞对EBV相关肿瘤的免疫效果及其机制进行深入研究;并探讨IL-21对LMP2特异性CD8+T细胞的免疫调节作用及其机制。本研究将为靶向EBV-LMP2疫苗的研究及其重复免疫与序贯免疫策略的开发提供参考，并为阐明疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答与患者临床收益之间的相关性提供了新手段和新思路，也将有助于细胞因子等辅助治疗策略的开发。本研究共包括以下几个方面的研究:
一、构建携带EBV-LMP2基因的复制缺陷型重组腺病毒疫苗rAd5-LMP2，并对其免疫原性进行深入研究。结果证实构建的rAd5-LMP2重组腺病毒含有目的基因LMP2，并有效表达LMP2蛋白。在动物试验中，对rAd5-LMP2疫苗的免疫剂量、检测时间点、免疫次数以及免疫途径进行了研究。ELISpot检测结果显示rAd5-LMP2疫苗免疫小鼠的最佳剂量为2×108TCID50/只/次，诱导的LMP2特异性T细胞免疫应答达到峰值;“初次免疫-力口强免疫1次”诱导的特异性T细胞免疫应答至少可维持16w;免疫次数为2-4次诱导的免疫效果最佳;“以皮下注射和肌肉注射两种途径接种免疫可获得相似水平的T细胞免疫效果。通过流式细胞术检测发现，疫苗诱导的LMP2特异性CD4+T细胞频率为0.65％，LMP2特异性CD8+T细胞频率为1.84％，表明rAd-LMP2疫苗可诱导LMP2特异性CD4+T细胞免疫应答和CD8+T细胞免疫应答，从而发挥双重抗肿瘤免疫应答效果。疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞经EBV-LMP2多肽刺激后，流式检测发现perforin+CD8+T细胞频率为0.42％、granzymeB+CD8+T细胞频率为0.67％和CD107a+CD8+T细胞频率为0.61％，三者均显著高于对照组小鼠，说明rAd-LMP2疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞具有细胞溶解能力。
二、为了深入研究LMP2特异性CD8+T细胞介导的杀伤功能及其机制，利用优化的rAd5-LMP2疫苗免疫接种策略免疫小鼠来诱生LMP2特异性CD8+T细胞。通过磁珠负性分选的方法从免疫小鼠脾脏淋巴细胞中富集CD8+T细胞，经流式细胞术检测CD8+T细胞的纯度为88.5％，其中LMP2特异性CD8+T细胞百分比为4.91％。深入研究了LMP2特异性CD8+CTL介导的杀伤功能及其机制的几个关键参数:“人均杀伤率(per capita killing rate)”、CTL协同杀伤效应、CTL与靶细胞比值、CTL杀伤维持时间以及不同途径介导的杀伤效率。在体外实验中，借助激光共聚焦成像系统直观观察到LMP2特异性CD8+T细胞对C3-LMP2-GFP靶细胞的特异性识别与杀伤过程:推测每天每个LMP2特异性CD8+T细胞杀死14-21个靶细胞;发现4个LMP2特异性CD8+CTL共同作用于一个靶细胞，比2个CD8+CTL介导的杀伤过程所需的时间降低了3倍，证明多个CD8+CTL共同作用于一个靶细胞具有协同杀伤效应，可显著提高杀伤效率;同时，借助实时细胞分析技术定量分析CTL与靶细胞比值对CTL杀伤功能的影响，发现LMP2特异性CD8+T细胞杀死所有靶细胞需要较高的效靶比，在低效靶比时无法清除残余的靶细胞。推测LMP2特异性CD8+T细胞在体内需要更高的效靶比，才能控制病情发展或消除肿瘤细胞。研究还发现LMP2特异性CD8+T可以通过穿孔素/颗粒酶途径和Fas/FasL途径发挥相似水平的细胞毒效应，但对靶细胞的“瞬时杀伤能力”主要依赖于穿孔素/颗粒酶途径，而Fas/FasL途径具有长时杀伤效应。
三、探讨了白细胞介素-21(Interleukin-21，IL-21)对LMP2特异性CD8+T细胞的免疫调节作用及其机制。研究证明，IL-21对LMP2特异性CD8+T细胞体外增殖的促进效果不明显，但IL-21可诱导LMP2特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B并增强其脱颗粒能力，从而促进LMP2特异性CD8+T细胞的杀伤功能。IL-21可诱导CD8十T细胞表达IL-21R的上调，通过与T细胞表达的IL-21R结合后，诱导CD8+T细胞内STAT3磷酸化，从而通过JAK/STAT3信号转导通路发挥免疫调节作用。
研究表明许多NPC患者体内仍具有一定程度的LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答，但未能控制疾病的发生。临床试验证实靶向EBV-LMP2疫苗直接免疫接种可在NPC患者体内增强LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答，并可在某些NPC患者中产生临床收益，但CTL应答与临床收益之间的相关性尚未阐明。目前，靶向EBV-LMP2免疫治疗策略亟需解决的难题是如何进一步提高患者的临床收益率。然而，靶向EBV-LMP2疫苗的研究尚主要集中于如何诱导强烈并持久的LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答，对于诱生的LMP2特异性CD8+T细胞介导的细胞毒作用及其机制的研究尚未见报道。此外，任何靶向EBV-LMP2疫苗开发所面临的重大挑战是疫苗诱生的LMP2特异性CD8+T细胞能否识别并杀死表达病毒逃逸蛋白LMP2的肿瘤细胞。因此，迫切需要阐明疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞介导的特异性细胞毒作用及其机制，并寻找有效的辅助治疗策略来增强NPC患者体内LMP2特异性CD8+T细胞的细胞毒性。这对于靶向EBV-LMP2疫苗的研究及其临床应用，并进一步提高NPC患者的临床反应率，是至关重要的。
本室前期研究中，构建了携带EBV-LMP2基因的重组腺病毒疫苗，在动物试验中证明是安全的，可诱导LMP2特异性T细胞免疫应答，但并未对疫苗的免疫接种策略和疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞介导的细胞毒性进行深入研究。本研究的目的在于构建携带EBV-LMP2基因的复制缺陷型重组腺病毒疫苗rAd5-LMP2，并对其免疫原性进行深入研究;开发新型LMP2特异性CD8+T细胞免疫效果评价体系，从而对疫苗免疫诱导的LMP2特异性CD8+T细胞对EBV相关肿瘤的免疫效果及其机制进行深入研究;并探讨IL-21对LMP2特异性CD8+T细胞的免疫调节作用及其机制。本研究将为靶向EBV-LMP2疫苗的研究及其重复免疫与序贯免疫策略的开发提供参考，并为阐明疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞免疫应答与患者临床收益之间的相关性提供了新手段和新思路，也将有助于细胞因子等辅助治疗策略的开发。本研究共包括以下几个方面的研究:
一、构建携带EBV-LMP2基因的复制缺陷型重组腺病毒疫苗rAd5-LMP2，并对其免疫原性进行深入研究。结果证实构建的rAd5-LMP2重组腺病毒含有目的基因LMP2，并有效表达LMP2蛋白。在动物试验中，对rAd5-LMP2疫苗的免疫剂量、检测时间点、免疫次数以及免疫途径进行了研究。ELISpot检测结果显示rAd5-LMP2疫苗免疫小鼠的最佳剂量为2×108TCID50/只/次，诱导的LMP2特异性T细胞免疫应答达到峰值;“初次免疫-力口强免疫1次”诱导的特异性T细胞免疫应答至少可维持16w;免疫次数为2-4次诱导的免疫效果最佳;“以皮下注射和肌肉注射两种途径接种免疫可获得相似水平的T细胞免疫效果。通过流式细胞术检测发现，疫苗诱导的LMP2特异性CD4+T细胞频率为0.65％，LMP2特异性CD8+T细胞频率为1.84％，表明rAd-LMP2疫苗可诱导LMP2特异性CD4+T细胞免疫应答和CD8+T细胞免疫应答，从而发挥双重抗肿瘤免疫应答效果。疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞经EBV-LMP2多肽刺激后，流式检测发现perforin+CD8+T细胞频率为0.42％、granzymeB+CD8+T细胞频率为0.67％和CD107a+CD8+T细胞频率为0.61％，三者均显著高于对照组小鼠，说明rAd-LMP2疫苗诱导的LMP2特异性CD8+T细胞具有细胞溶解能力。
二、为了深入研究LMP2特异性CD8+T细胞介导的杀伤功能及其机制，利用优化的rAd5-LMP2疫苗免疫接种策略免疫小鼠来诱生LMP2特异性CD8+T细胞。通过磁珠负性分选的方法从免疫小鼠脾脏淋巴细胞中富集CD8+T细胞，经流式细胞术检测CD8+T细胞的纯度为88.5％，其中LMP2特异性CD8+T细胞百分比为4.91％。深入研究了LMP2特异性CD8+CTL介导的杀伤功能及其机制的几个关键参数:“人均杀伤率(per capita killing rate)”、CTL协同杀伤效应、CTL与靶细胞比值、CTL杀伤维持时间以及不同途径介导的杀伤效率。在体外实验中，借助激光共聚焦成像系统直观观察到LMP2特异性CD8+T细胞对C3-LMP2-GFP靶细胞的特异性识别与杀伤过程:推测每天每个LMP2特异性CD8+T细胞杀死14-21个靶细胞;发现4个LMP2特异性CD8+CTL共同作用于一个靶细胞，比2个CD8+CTL介导的杀伤过程所需的时间降低了3倍，证明多个CD8+CTL共同作用于一个靶细胞具有协同杀伤效应，可显著提高杀伤效率;同时，借助实时细胞分析技术定量分析CTL与靶细胞比值对CTL杀伤功能的影响，发现LMP2特异性CD8+T细胞杀死所有靶细胞需要较高的效靶比，在低效靶比时无法清除残余的靶细胞。推测LMP2特异性CD8+T细胞在体内需要更高的效靶比，才能控制病情发展或消除肿瘤细胞。研究还发现LMP2特异性CD8+T可以通过穿孔素/颗粒酶途径和Fas/FasL途径发挥相似水平的细胞毒效应，但对靶细胞的“瞬时杀伤能力”主要依赖于穿孔素/颗粒酶途径，而Fas/FasL途径具有长时杀伤效应。
三、探讨了白细胞介素-21(Interleukin-21，IL-21)对LMP2特异性CD8+T细胞的免疫调节作用及其机制。研究证明，IL-21对LMP2特异性CD8+T细胞体外增殖的促进效果不明显，但IL-21可诱导LMP2特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B并增强其脱颗粒能力，从而促进LMP2特异性CD8+T细胞的杀伤功能。IL-21可诱导CD8十T细胞表达IL-21R的上调，通过与T细胞表达的IL-21R结合后，诱导CD8+T细胞内STAT3磷酸化，从而通过JAK/STAT3信号转导通路发挥免疫调节作用。