【摘 要】
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利用小分子荧光探针研究活细胞中蛋白质的定位和功能已经成为生命科学领域中很有力的工具。利用小分子荧光探针与蛋白（短肽）标签的特异性配对标记技术，我们可以对活细胞中的蛋白
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利用小分子荧光探针研究活细胞中蛋白质的定位和功能已经成为生命科学领域中很有力的工具。利用小分子荧光探针与蛋白（短肽）标签的特异性配对标记技术，我们可以对活细胞中的蛋白进行成像。虽然这个领域已经取得了一些进展，但存在的问题主要是多数蛋白标签分子量较大会干扰靶蛋白的功能以及大多数小分子荧光探针背景荧光高，不能免洗标记。 在本研究中，我们基于短肽和小分子探针特异性配对开发了荧光激活型探针与组氨酸标签短肽(His-tag)特异性识别的蛋白质荧光标记技术。在该系统中，小分子探针本身没有荧光，当与His-tag特异性非共价结合后，小分子探针与邻近的半胱氨酸(Cys)的巯基进行亲核共价结合，探针被激活产生荧光。探针与蛋白标记过程中不会产生游离的分子，避免对细胞的潜在危害。通过研究，我们得到了由10个氨基酸组成的HC短肽和探针Coun-Ni2配对标记系统。融合HC短肽的靶蛋白分子可以和探针Coun-Ni2特异性共价标记并激活探针产生荧光，荧光增强倍数接近170倍。在哺乳动物细胞中，利用Coun-Ni2成功实现了对融合HC短肽的跨膜蛋白的免洗标记。短肽HC分子量小和内源性蛋白中少见，不会干扰靶蛋白的功能，是一种理想的短肽标签;探针Coun-Ni2是荧光激活型探针，可用于蛋白和细胞免洗标记。在今后的研究中，该标记系统进一步可用于GPCR以及B2R等膜蛋白的研究。 此外，我们还基于SNAP-tag蛋白质荧光标记技术开发了新的SNAPf蛋白质荧光标记系统，并将该标记系统进一步开发成氧化还原荧光探针(roSNAPf)，roSNAPf对氧化还原条件具有较好的响应。比起其他氧化还原探针，roSNAPf具有颜色多样，耐光性好等优点，是一个很有应用前景的氧化还原探针。
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