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目的:
1.观察大黄素对高糖培养的GMC增殖与ECM的主要成分-FN的影响。
2.观察大黄素对高糖培养的GMC P38MAPK信号转导通路的影响，以深入研究大黄素抗DN的分子机制。
方法:
大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)常规培养于含20％胎牛血清的MEM培养基中，于37℃，饱和湿度，5％C02的细胞培养箱中培养。每2-3天用含0.25％EDTA的胰酶消化传代。
1.实验分组:
1)正常组(5.6 mM glucose，NG)2)甘露醇组(5.6 mM glucose+24.4 mM mannitol)3)高糖组(30 mM glucose，HG)4)高糖+SB203580(10μM)：P38MAPK抑制剂5)高糖+大黄素15 μM6)高糖+大黄素30 μM7)高糖+大黄素60 μM实验用DMSO作为溶媒溶解药物，DMSO终浓度为0.1％。
2. MTT比色法检测大黄素对高糖培养24 H大鼠GMC活力的影响。
3.流式细胞仪检测大黄素对高糖培养24 H大鼠GMC细胞周期的影响。
4. RT-PCR法检测大黄素对高糖培养24 H大鼠GMCFN mRNA的影响。
5. Westem blot检测大黄素对高糖培养24 H大鼠GMC t-P38MAPK、P-P38MAPK、p-CREB、PPARr、CTGF、FN等蛋白表达的影响。
结果:
1.大黄素对高糖培养的GMC细胞活力的影响MTT法观察细胞活力的变化，结果发现高糖能够剂量和时间依赖性的促进大鼠GMC增殖，其中30mM高糖培养24H达到到较理想的结果；大黄素能够剂量和时间依赖性的抑制高糖培养的大鼠GMC的增殖，其中60 μM作用24H达到较理想的抑制效应，最后选择15，30，60μM三个剂量进行实验；而用大黄素对未加糖培养的细胞进行干预，结果发现15-60μM的大黄素对正常培养细胞活力没有明显的影响，说明我们选的三个剂量对细胞是没有毒性的；另外实验结果发现，10μM的P38MAPK特异性抑制剂SB203580能显著抑制高糖诱导的大鼠GMC增殖，与高糖组比有显著性意义(P<0.05)，而甘露醇组和溶媒对照DMSO组对细胞增殖没有明显的影响(P>0.05)。
2.大黄素对高糖培养的GMC细胞周期的影响利用流式细胞仪观察大黄素对高糖培养的大鼠GMC细胞周期的影响，结果发现，高糖组S,G2/M期细胞的比例明显增多，G0/G1期细胞含量明显减少，说明高糖能够诱导细胞由G0/G1进入S期从而促进了细胞的增殖，大黄素能够剂量依赖性的阻滞细胞周期于G0/G1期，其中高剂量组效应同SB203580效应相当，与正常对照比没有明显的差异，甘露醇对细胞周期没有明显的影响。
3.大黄素对高糖培养的GMC FN表达的影响高糖能够明显诱导GMC FN mRNA和蛋白表达增加，与正常对照比差异有显著意义(P<0.05)，大黄素各剂量组及10μM SB302580均能抑制高糖诱导的GMC FN mRNA和蛋白水平，与高糖组比差异有显著意义(P<0.05)，其中大黄素高剂量组同SB203580效应相当，与正常对照比没有显著统计学差异(P>0.05)；甘露醇组与正常对照比没有明显的差异(P>0.05)。
4.大黄素对高糖培养的GMC P38MAPK蛋白表达的影响高糖能够明显的促进GMC p-P38MAPK的表达增加，与正常对照比差异有显著性意义(P<0.05)；大黄素呈剂量依赖性的抑制高糖诱导的GMC p-P38MAPK的表达，与高糖组比有显著统计学意义(P<0.05)，其中大黄素高剂量组、10μSB203580与正常对照比没有明显的统计学差异(P>0.05)；而‘t-P38MAPK蛋白表达各个组之间没有明显的统计学差异(P>0.05)，提示SB203580及大黄素并不是通过提高GMC P38MAPK．的表达而是通过抑制其磷酸化水平来发挥作用的。甘露醇组与正常组比无显著性差异(P>0.05)，提示高糖诱导的P38MAPK的活化不是高渗透压引起的。
5.大黄素对高糖培养的GMC CREB蛋白表达的影响高糖能明显诱导GMC CREB的磷酸化水平，与正常对照比有显著差异(P<0.05)，大黄素各剂量能够抑制高糖诱导的GMC p-CREB表达，与高糖组比有显著性差异(P<0.05)，其中大黄素高剂量组、10μM SB203580同正常对照组比没有明显的统计学差异(P>0.05)。甘露醇组与正常对照组比没有明显的差异(P>0.05)。
6.大黄素对高糖培养的GMC PPARγ蛋白表达的影响高糖能够明显抑制GMC PPARγ的表达，与正常对照组比有显著统计学差异(P<0.05)，大黄素各剂量组及10μM SB302580均能上调高糖培养的GMCPPARγ,蛋白表达，与高糖组比有显著统计学差异(P<0.05)，其中大黄素高剂量组、10γM SB302580与正常对照比没有明显统计学差异(P>0.05)；甘露醇组与正常组相比无显著性差异(P>0.05)。
7.大黄素对高糖培养的GMC CTGF蛋白表达的影响高糖能够明显诱导GMC CTGF的表达，与正常对照组比有显著统计学差异(P<0.05)；大黄素各剂量组均能抑制高糖诱导的CTGF表达，与高糖组比有显著统计学差异(P<0.05)，其中大黄素高剂量组、10μM SB302580与正常对照比没有明显统计学差异(P>0.05)；甘露醇组与正常对照组比有显著统计学差异(P>0.05)。
结论:
高糖能诱导GMC增殖与纤维连接蛋白的表达增加，大黄素能够显著抑制高糖诱导的GMC增殖与FN的高表达，其作用与大黄素调节P38MAPK信号传导通路如抑制p-P38MAPK与p-CREB的表达、增强PPARγ的表达、降低CTGF的表达等密切相关。