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高效毛细管电泳是八十年代初发展起来的一种新型分离技术,该技术具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、高灵敏度、易于自动化等特点,因此在化学、生命科学、临床医学、药学等领域具有广泛的应用.特别是在核酸分析方面,例如PCR产物分析、酶切片段、突变检测、基因类型以及序列分析等方面,高效毛细管电泳是一种非常有效的分析工具.
激光诱导荧光检测是所有检测方法中灵敏度最高的一种检测方法.它与毛细管电泳技术结合,成为了一种高灵敏、高选择性的分析方法,被广泛地应用于微量生物样品的分析.本论文旨在以毛细管电泳一激光诱导荧光系统为分析手段,发展核酸的定量分析和基因突变检测新方法,主要内容如下:
(1)毛细管电泳核酸定量分离分析.毛细管电泳核酸定量分离分析在临床诊断、基因突变检测以及基因序列测定等方面具有广泛的应用,因此建立一种简单、快速、稳定、高灵敏的定量分离分析方法具有重要的应用价值.我们系统研究了电泳条件对DNA定量分离分析的影响,建立了核酸定量分析方法.着重研究了三种荧光染料(EvaGreen,SYBR Green I和SYBR Gold)对DNA定量分析的影响.实验发现EvaGreen比SYBR Green I和SYBR Gold具有较宽的线性范围,他们的检测限并没有非常明显的差别.同时我们发现采用以上三种染料时φX174 DNA片均得到了很好的分离,其中EvaGreenφX174.DNA片段进行分离分析时的重现性要稍优于SYBR Green I和SYBR Gold两种染料,在同一天内测得迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.24～0.27﹪和3.45～7.59﹪;在连续三天内测得迁移时间和峰面积的相对标准偏差为1.35～1.63﹪和6.72～12.05﹪.我们建立了毛细管电泳核酸定量分析方法,并成功地用于人的循环血DNA的定量研究.与其他定量方法相比,该方法具有自动化高、简单、快速等优点.
(2)毛细管区带电泳循环血DNA定量法与实时定量PCR定量法的对照.毛细管区带电泳循环血DNA定量法与其他定量方法的相关性一直是我们所非常关注的问题,因此我们对其进行了一系列的评价,并与循环血DNA定量的"金"标准.实时定量PCR的方法作以对照.实验测得毛细管区带电泳日内和日间相对标准偏差分别为4.19﹪和6.91﹪.同一根涂层毛细管以及不同涂层毛细管之间的相对标准偏差分别为5.14﹪和9.02﹪.测得实时定量PCR的线性方程为:y=-3.32x+36.92,其中x值代表起始拷贝数的对数,v值代表Ct值,其相关系数为:R<'2>=0.996,批内和批间相对标准偏差分别为7.3﹪和14.92﹪.我们还同时用三种方法(real-time PCR,CZE<'1>,CzE<'2>)对50个正常人的血清样品进行测定,结果表明毛细管区带电泳和实时定量PCR两种方法的相关性非常好,而且进一步证明血样的采集等处理步骤对循环血DNA水平有重要的影响.
(3)基于逆流衍生基因突变检测方法研究.我们将逆流衍生标记法成功地用于恒变性剂毛细管电泳以及单链构象多态性分析两种基因突变检测方法中.我们分别用SYBR Gold和EvaGreen两种染料为DNA荧光内插试剂,对MTHFR基因的C677T进行了突变检测.系统地研究了实验条件对突变检测的影响,选择4M的尿素和20﹪的甲酰胺作为变性剂,6﹪的线性丙烯酰胺作为筛分介质.在恒变性剂毛细管电泳突变检测中,应用两种染料均得到很好的结果,对于杂合子样品得到了两条同源双链DNA以及两条异源双链DNA的峰.同时采用柱上衍生法进行实验,发现对于杂合子样品得到分离度非常差、荧光信号比较弱的四个峰,更有趣地是在温度达到54℃以上时,荧光信号非常弱,不能被检测器检测到.荧光标记引物是基因突变检测中应用最广泛的一种标记方式,因此我们同时用荧光标记引物的方法作了对照实验;在单链构象多态性分析中,对于杂合子样品我们得到了四条单链DNA的四个峰,纯合子样品得到两条单链的两个峰,实验还进一步证明EvaGreen这种新型荧光染料还可以应用于单链DNA的分析.我们的结果初步表明逆流衍生的柱后标记方式可以成功地用于恒变性剂毛细管电泳以及单链构象多态性分析方法的基因突变检测.
(4)基于MutS蛋白分子识别基因突变检测方法研究.MutS蛋白是DNA错配修复系统的重要组成部分,MutS蛋白能够识别并结合八种错配DNA双链,以及由碱基修饰引起的错配,还能识别结合1-4个核苷酸插入或缺失形成的loop环结构.多种基于MutS蛋白分子识别基因突变/多态性的检测技术,相对比较复杂,而且成本比较高.为此我们偿试用毛细管电泳.激光诱导荧光的系统对基于MutS分子识别基因突变及多态性进行初步探索.实验中我们选择0.5﹪的PVP作为筛分介质,成功地发现MutS蛋白对错配DNA双链有较强的结合能力,同时还发现对完全匹配DNA双链仍有轻微的非特异性吸附.我们的结果表明毛细管电泳与MutS蛋白分子识别技术结合可能成为基因突变检测新方法.