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5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinicacid，ALA)在农业生产中具有广泛的应用，不仅可作为除草剂、杀虫剂，还可提高植物的抗盐、抗冷冻能力，这对于缓解生态环境恶化，提高农业生产水平具有重要的现实意义。此外，5-氨基酮戊酸也被广泛用于肿瘤的诊断及癌症的治疗方面。目前，ALA的工业化生产主要是利用光合细菌突变株和大肠杆菌的重组菌表达5-氨基酮戊酸合酶，该酶在细胞内催化琥珀酰辅酶A和甘氨酸缩合成ALA。ALA的生物合成受终产物血红素的反馈抑制。本研究中，采用大肠杆菌重组技术，表达了有活性的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的5-氨基酮戊酸合酶，研究重组菌株合成ALA的能力，并测定胞内和胞外ALA的产量。初步分析了影响细胞合成ALA的一些限制因子，摸索了ALA的快速纯化方法。结果表明：
1.根据已公布的hem1基因的全序列，以酿酒酵母基因组为模板，去除N端导肽序列的核苷酸序列，以编码Asn63为第一个氨基酸残基，上游引物编码的起始氨基酸为Met，设计并合成引物，采用PCR扩增出一个大小约为1.4-1.5kb的特异DNA片段，采用载体pMAL-2x，构建重组ALAS表达载体pMAL-ALAS，通过酶切验证初步证明外源基因片段已正确插入载体pMAL-2x，进一步测序表明插入的外源片段同已公布的酿酒酵母hem1基因片段的序列完全相同。
2.重组载体和对照分别转化大肠杆菌表达菌株，生长24h的菌落在紫外光下显示强烈红色荧光，表明有下游的中间物的氧化形式卟啉的积累。携带重组载体的菌株生长速度落后于对照菌株，可能是积累的卟啉会产生自由基，对细胞膜产生破坏作用，抑制了细胞的生长。诱导后的大肠杆菌重组菌显示重组蛋白表达为可溶性，SDS-PAGE分析表明ALAS蛋白亚基分子量约为49kDa。诱导物IPTG浓度为0.10mmol/L时ALAS酶活达最大。
3.分析了影响ALA生物合成的一些限制因子。不同的pH值对重组菌ALA的合成影响很大，pH7.0时酶活最高，而在pH6.5时ALA的产量与菌液浓度的比值最大。添加外源前底物琥珀酸对ALA产量产生影响且在20mmol/L时影响最大。添加20mmol/L的甘氨酸刺激细胞ALA的合成且产量最高，而浓度高于80mmol/L的甘氨酸会抑制菌体生长。
4.国产的大孔径树脂纯化ALA结果表明大孔径树脂Ⅰ对ALA以外的杂物质有吸附作用，大孔径树脂Ⅱ对ALA有专一性吸附作用，经过二步层析后得到的ALA溶液，冷冻干燥，毛细管电泳分析确定ALA纯度很高。
综上所述，本文已成功地从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组克隆出编码成熟5-氨基酮戊酸合酶的基因片段，并构建了高效原核表达载体pMAL-ALAS，研究了影响细胞ALA合成的部分限制因子，初步探讨了快速廉价的ALA纯化方法，这Ⅰ些结果为重组工程菌合成重要的生物活性物质ALA奠定了良好的前期基础。