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当前养猪生产中,疾病特别是传染性疾病是长期困扰养猪业的主要难题。因此,如何摆脱养猪业对药物的过度依赖,提高猪自身的免疫力和抗病力,成为当前养猪业发展中亟待解决的问题。前期研究发现我国的地方猪种大蒲莲猪在抗病性和免疫力方面明显优于国外猪种长白猪。这两个猪品种在不同的环境和选择压力下进化而来,是寻找抗病和免疫相关基因的优良素材。因此,对两猪种免疫应答以及免疫相关差异表达基因的研究,对探索猪抗病力差异的遗传基础和免疫机理有深远的意义。含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的单链脱氧寡核苷酸(oligodeoxynucleotides containing unmethylated Cp G motifs,Cp G ODN)能够与TLR9结合,直接激活机体的先天免疫系统,诱导产生以Th1型为主的免疫应答,进而间接激活获得性免疫系统。因此,Cp G ODN被广泛应用于肿瘤、癌症、病毒感染以及过敏性疾病的治疗。此外,Cp G ODN在作为疫苗佐剂方面显现出广阔的应用前景。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸系统障碍为特征的传染性疾病。该病在世界范围内频繁爆发,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,该病最主要的防治措施就是接种疫苗。因此,迫切需要有效的疫苗佐剂来增强其免疫反应。1、大蒲莲猪和长白猪血液生理生化指标比较对红细胞、白细胞、血小板、淋巴细胞、中间细胞、粒细胞结果进行了统计,结果表明:大蒲莲猪血液中的红细胞(P<0.01)和淋巴细胞(P<0.05)明显高于长白猪,其他统计指标在两猪种中并未找到显著差异(P>0.05)。对大蒲莲猪和长白猪的血液生化指标统计表明:长白猪的碱性磷酸酶(P<0.05)和白蛋白(P<0.01)明显高于大蒲莲猪,但是大蒲莲猪的谷草转氨酶(P<0.05)明显高于长白猪。2、Cp G ODN刺激大蒲莲猪和长白猪全血后免疫指标比较结果显示在大蒲莲猪中IL1β(P<0.05)的蛋白表达水平明显高于长白猪;而长白猪中IL12(P<0.05)和C(P<0.05)反应蛋白的蛋白表达量高于大蒲莲猪。3、Cp G ODN对大蒲莲猪和长白猪基因表达差异研究Cp G ODN注射大蒲莲猪和长白猪后,取全血提取RNA进行转录组测序,把结果进行生物信息学分析后,在这两组样品中共鉴定了500个差异表达基因,64.2%(321基因)的差异表达基因在长白猪中高表达,35.8%(179基因)在大蒲莲猪中高表达。对这些差异表达基因进行GO和KEGG通路富集分析,研究结果表明免疫相关的差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路。值得注意的是82.8%的免疫相关的差异表达基因(24/29)在大蒲莲猪中高表达,例如IL1α,IL1β,CXCL8,CXCL10,CCL19,CXCR6(DPL/Landrace倍数变化分别为3.33,1.74,5.63,2.24,5.55和3.55)。只有17.2%(5/29)的免疫相关的差异表达基因在长白猪中高表达,例如My D88,CCL23,CCR2和IRF5(Landrace/DPL的倍数变化分别为6.1845,1.34,1.39和1.20)。COG分析后,发现500个差异表达基因共分成了25个COG分类,其中R聚类的差异表达基因最多,其次为J和T。为了验证RNA-seq结果,q RT-PCR用来验证6个免疫相关的差异表达基因,荧光定量结果与高通量结果相一致,结果表明高通量结果的准确性和可靠性。挑选了高通量筛选的免疫相关的差异表达基因进行了体内结果验证。对体内处理前和处理后的结果进行了分析,结果显示TLR9基因在两个猪种处理前和处理后并没有差异,其中CXCL9和IL1α在两个猪种处理前和处理后都没有差异,但刺激后大蒲莲猪的倍数变化高于长白猪。IL8、CXCL13、CCL3L1和CCL19处理后在大蒲莲猪中表达量高于长白猪,IL1β和CXCL2在两个猪种中都没有差异。CXCL10在处理后两个猪种中都高表达,但是大蒲莲猪仍然高于长白猪。对SNP和可变剪切事件分析后,发现大蒲莲猪平均SNP个数为81893,长白猪平均SNP个数为32021,大蒲莲猪的SNP个数是长白猪的两倍还多。Genic SNPs数目在大蒲莲猪中高于长白猪,Intergenic SNP在长白猪中高于大蒲莲猪,而Transition、Transversion、Heterozygosity在两个猪种中的个数相似。SNP类型中,大蒲莲猪的碱基替换均高于长白猪。通过对长白猪和大蒲莲猪可变剪切进行分析和比较,Skipped Exon、Alt3splice、Intron Retention和Alt First Exon是两个猪种主要的可变剪切。其中,Skipped Exon和Alt Frist Exon在大蒲莲猪中高于长白猪。其他可变剪切在两个猪种中的分布相似。体外Cp G ODN刺激大蒲莲猪和长白猪PBMC后,q RT-PCR研究结果表明,大蒲莲猪TLR9基因的表达量在刺激前和刺激后显著高于长白猪。同时对细胞因子和趋化因子进行了荧光定量检测,结果表明细胞因子(IFNα、IL8、IL12 p40)和趋化因子(CXCL9和CXCL13)在刺激后的基因表达水平显著高于长白猪。4、CpG ODN增强PRRSV灭活疫苗免疫力研究体外研究结果显示Cp G ODN-PRRSV灭活抗原孵育的Mo DCs中Th1型细胞因子的(IFN-γ和IL-12 P40)的m RNA表达水平显著增加,Th2型细胞因子中只有IL4的m RNA表达水平显著增加。然而蛋白表达水平只有IFN-γ显著升高。为了进一步研究Cp G ODN-PRRSV对Mo DCs的作用机制,研究了Cp G ODN与PRRSV孵育组对TRIF/My D88-NF-κB信号通路的影响。对通路节点基因表达水平分析后,发现TRIF、My D88和NF-κB p65 m RNA表达水平都升高,但是只有My D88和NF-κB P65的表达水平达到显著差异。检测NF-κB P65在细胞中的蛋白表达水平,结果表明共同孵育组的蛋白表达水平显著升高。综上所述,大蒲莲猪和长白猪的血液生理生化指标,Cp G ODN体外刺激全血后的蛋白表达水平,Cp G ODN体内和体外刺激后的基因表达水平存在差异。此外,TLR9配体Cp G ODN可通过TLR/My D88-NF-κB信号通路增强Mo DCs的抗原递呈功能。这些结果为研究中外猪种抗病力差异的遗传和免疫机理以及Cp G ODN作为疫苗佐剂提供了理论基础。