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目的：特发性肺纤维化是一种致命性的肺间质性肺疾病，因病因不明，临床表现不典型，早期诊断困难，目前尚缺乏有效的治疗方法。肺Ⅰ、Ⅱ型上皮细胞功能障碍是导致急性肺损伤和肺纤维化的重要原因，修复肺泡上皮细胞功能可以治疗肺疾病。基因治疗被视为治疗IPF最有前景的方法之一。本项目对YY1在肺泡上皮细胞中调控作用进行深入研究，探讨其在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞中对TGF-β刺激的炎症发生、纤维化形成和上皮细胞间质转型的调控作用，研究YY1在IPF的作用机制。
方法：(1)分离小鼠体内肺上皮细胞和成纤维细胞，qRT-PCR检测检测YY1的表达；观察A549和R3/1细胞形态，检测纤维化标志分子的表达。(2)以不同浓度的TGF-β刺激A549细胞，光镜下观察细胞变化，免疫荧光染色和qRT-PCR检测α-sma的表达；qRT-PCR检测TGF-β刺激A549细胞后纤维化相关基因的表达。(3)qRT-PCR和Westernblot检测TGF-β刺激A549和R3/1细胞后YY1的表达。(4)通过YY1过表达技术，检测A549细胞中纤维化相关基因的表达，免疫荧光染色和Westernblot检测TGF-β刺激A549细胞后α-sma的表达。(5)构建A549YY1shRNA稳定株，Westernblot检测纤维化标志分子的表达变化。(6)通过CCK8实验检测YY1对A549细胞增殖的影响。(7)过表达YY1的A549细胞经TGF-β刺激后，qRT-PCR、Westernblot检测核转录因子NF-κB的表达；通过质核分离蛋白提取技术，Westernblot检测细胞质和细胞核中NF-κB的分布和位移，免疫荧光染色检测在TGF-β刺激A549细胞中YY1对NF-κB入核的影响。
结果：(1)小鼠成纤维细胞中YY1表达量高。R3/1细胞形态为类成纤维细胞的长梭形，与A549细胞相比，纤维化标志分子α-sma和vimentin表达高。(2)5ng/mL或者20ng/mL的TGF-β刺激均能使圆形、鹅卵石状的A549细胞形态改变为长梭形，而且TGF-β刺激A549细胞可以显著增加纤维化标志分子α-sma、collagen的表达，降低紧密结合相关基因claudin-1和ZO-1的表达。(3)TGF-β可以促进A549细胞中YY1的表达，但对R3/1中YY1的表达无明显作用。(4)过表达YY1可以促进A549细胞向间质细胞转分化，显著增加TGF-β诱导的A549细胞中α-sma表达。(5)敲低YY1的表达可以抑制TGF-β诱导的EMT进程，抑制α-sma和vimentin的表达。(6)YY1促进A549细胞增殖。(7)过表达YY1对A549细胞中NF-κB的基因和总蛋白表达无明显变化，但Westernblot结果显示YY1过表达组细胞核内的NF-κB蛋白显著增加，免疫荧光结果显示，YY1能进一步促进TGF-β刺激细胞质中的NF-κB向细胞核发生转位。
结论：YY1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中可以通过激活NF-κB信号通路促进肺纤维化，抑制YY1的表达可能为IPF的治疗提供一条新途径。
方法：(1)分离小鼠体内肺上皮细胞和成纤维细胞，qRT-PCR检测检测YY1的表达；观察A549和R3/1细胞形态，检测纤维化标志分子的表达。(2)以不同浓度的TGF-β刺激A549细胞，光镜下观察细胞变化，免疫荧光染色和qRT-PCR检测α-sma的表达；qRT-PCR检测TGF-β刺激A549细胞后纤维化相关基因的表达。(3)qRT-PCR和Westernblot检测TGF-β刺激A549和R3/1细胞后YY1的表达。(4)通过YY1过表达技术，检测A549细胞中纤维化相关基因的表达，免疫荧光染色和Westernblot检测TGF-β刺激A549细胞后α-sma的表达。(5)构建A549YY1shRNA稳定株，Westernblot检测纤维化标志分子的表达变化。(6)通过CCK8实验检测YY1对A549细胞增殖的影响。(7)过表达YY1的A549细胞经TGF-β刺激后，qRT-PCR、Westernblot检测核转录因子NF-κB的表达；通过质核分离蛋白提取技术，Westernblot检测细胞质和细胞核中NF-κB的分布和位移，免疫荧光染色检测在TGF-β刺激A549细胞中YY1对NF-κB入核的影响。
结果：(1)小鼠成纤维细胞中YY1表达量高。R3/1细胞形态为类成纤维细胞的长梭形，与A549细胞相比，纤维化标志分子α-sma和vimentin表达高。(2)5ng/mL或者20ng/mL的TGF-β刺激均能使圆形、鹅卵石状的A549细胞形态改变为长梭形，而且TGF-β刺激A549细胞可以显著增加纤维化标志分子α-sma、collagen的表达，降低紧密结合相关基因claudin-1和ZO-1的表达。(3)TGF-β可以促进A549细胞中YY1的表达，但对R3/1中YY1的表达无明显作用。(4)过表达YY1可以促进A549细胞向间质细胞转分化，显著增加TGF-β诱导的A549细胞中α-sma表达。(5)敲低YY1的表达可以抑制TGF-β诱导的EMT进程，抑制α-sma和vimentin的表达。(6)YY1促进A549细胞增殖。(7)过表达YY1对A549细胞中NF-κB的基因和总蛋白表达无明显变化，但Westernblot结果显示YY1过表达组细胞核内的NF-κB蛋白显著增加，免疫荧光结果显示，YY1能进一步促进TGF-β刺激细胞质中的NF-κB向细胞核发生转位。
结论：YY1在肺泡Ⅱ型上皮细胞中可以通过激活NF-κB信号通路促进肺纤维化，抑制YY1的表达可能为IPF的治疗提供一条新途径。