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近年来,在肿瘤治疗领域,人们越来越多地致力于利用自身免疫系统来抵御肿瘤,这种通过调动机体免疫系统,抑制和杀伤肿瘤细胞的方法称为肿瘤免疫治疗。肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向,其中包括细胞免疫疗法、肿瘤疫苗,以及免疫检查点抑制剂等研究热点,并已取得了很多具有应用前景的研究成果。免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下,免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受,然而,机体在受到肿瘤侵袭时,免疫检查点的激活可抑制自身免疫,有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。目前,已批准上市两个免疫检查点——CTLA-4和PD-1——的靶向药物。程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是一种诱导表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞等表面的共刺激分子,两个天然配体分别为PD-L1和PD-L2,表达于肿瘤细胞和抗原递呈细胞。激活PD-1/PD-L通路对已活化的T细胞有反向调控作用,降低T细胞活性,甚至诱导其凋亡。反之,阻断PD-1/PD-L通路可以增强T细胞活性以达到肿瘤免疫治疗的效果。因此,研究PD-1/PD-L信号通路调节T细胞活性的机制对肿瘤发生和发展,自身免疫性疾病和慢性病毒感染均具有重要的生物学意义。目前,针对PD-1/PD-L1,FDA已批准上市3个单克隆抗体(Opdivo、Keytruda、Tecentriq),主要适应症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌,以及膀胱癌等,均取得了较好的疗效,能够明显延长患者的总生存期,副作用相对化疗药物较小。无论是针对PD-1,还是PD-L1,尽管单克隆抗体药物研究是一个热门课题,但是,关于小分子抑制剂的研究报道却很少,甚至尚未有进入临床阶段的小分子抑制剂。然而,PD-1/PD-L通路小分子抑制剂的研究具有巨大的潜在应用价值,因为小分子抑制剂不仅可以克服单克隆抗体药物所具有的免疫源性副作用和成药性方面的不足,而且还可以降低生产成本,节约治疗费用。为此,本论文的工作将以PD-1/PD-L1通路为靶,借助计算机辅助药物设计,采用有机合成等手段,构建具有潜在应用前景的先导化合物。确定上述研究目标之后,本论文的工作将面临3个难点:(1)基于蛋白-蛋白相互作用(PPI)的结合位点。因为PPI界面具有开放性、动态性和广泛性等特点,为设计小分子化合物带来巨大的困难,致使以PPI为靶,设计小分子药物成为本领域公认的一大挑战。(2)研究之初,尚未有公开的、在分子水平进行活性评价的体系,无法对虚拟筛选出的化合物进行及时、快速的评价。(3)针对PD-1/PD-L1通路,尚无小分子抑制剂的研究报道,致使发现具有活性的小分子抑制剂处于一个从无到有的状态。针对以上问题,开展了以下研究工作:1.以鼠源PD-1/PD-L1复合晶体为靶的小分子抑制剂的发现因尚未有人源PD-1/PD-L1复合晶体的报道,研究初期阶段,本论文选择鼠源PD-1与人源PD-L1的复合晶体(PDB code:3BIK)为出发点,采用分子对接与虚拟筛选进行基于受体结构的计算机辅助药物设计,对自有小分子数据库,以及Maybridge数据库等进行优化,筛选出若干小分子化合物进行生物活性评价,确定适合结构改造的先导化合物str149,以二甲氨基苯甲酸酯为母核,设计合成了13个衍生物,其中2个化合物活性高于str149。通过分析以上小分子化合物的构-效关系,探索了此类化合物结合靶蛋白的机制,对后续研究起到示范作用。目前尚无分子水平的PD-1/PD-L1小分子抑制剂活性评价体系的报道,如何在分子水平上评价小分子抑制剂的活性是一个重要的问题。为此,本论文建立了正反2种ELISA模型,即―包被PD-1重组蛋白‖和―包被PD-L1重组蛋白‖,验证了模型的可靠性,使之成为快速检测小分子抑制剂活性的实验平台。在自建的ELISA检测模型上获得的实验数据,与后期使用的HTRF模型上获得的实验数据具备一致性,ELISA检测模型的结果较HTRF模型的结果整体上低10%左右,这是由于ELISA体系自身的局限性所致。综上所述,自建的ELISA检测模型与HTRF检测模型形成相互印证,最大限度地排除了单一检测方法可能导致的假阳性小分子的存在,确保所筛选的先导化合物的可靠性。因此,本论文所建立的―计算机设计-小分子化合物的合成-生物活性评价‖体系,为快速筛选小分子抑制剂奠定了基础。2.以人源PD-1/PD-L1复合晶体为靶的小分子抑制剂的发现2015年12月,人源PD-1/PD-L1复合晶体结构(PDB code:4ZQK)首次见诸报道,对比人源和鼠源复合晶体中的PD-1蛋白,分析处于PD-1/PD-L1相互作用表面不同的氨基酸,本论文对人源PD-1进行分子对接,着重对Maybridge数据库以及FDA库进行化合物活性筛选,共选出150个化合物在HTRF检测模型上进行活性评价。其中活性较好的化合物RH02220和RJC04089,在100?M下对PD-1/PD-L1的抑制率超过50%。为此,我们以RH02220和RJC04089为模板,进行相似性搜索,得到36个相似度达70~95%的化合物,再次进行活性评价,最终选择活性较优、结构合理的化合物RJC04089和XBX00144作为结构改造的先导化合物。如前所述,PD-1/PD-L1复合晶体为靶的小分子化合物设计,由于活性位点为PPI模式,致使计算机设计和筛选先导化合物的难度很大。充分了解蛋白表面活性位点是此项研究的重要工作,有助于发现先导化合物。因此,我们针对PD-L1与PD-1作用的关键氨基酸121-125,设计了13条五肽小分子,探索了5个氨基酸残基在PD-1/PD-L1结合时的作用关系,从蛋白质结合角度为发现先导化合物做了基础性的研究工作。3.以人源PD-L1与化合物复合晶体为靶的小分子抑制剂的发现2016年4月,活性小分子(BMS-202)与h PD-L1的复合晶体(PDB code:5J89)首次见诸报道,揭示了该类抑制剂干扰PD-1/PD-L1结合的机制是诱导PD-L1二聚化,占据PD-L1与PD-1结合的活性表面,从而抑制PD-L1与PD-1结合。该机制为设计小分子抑制剂提供了一个全新的视角。有别于前2种模型中小分子的结合位点是在蛋白结构表面,该复合晶体中,PD-L1是在BMS-202的诱导下形成二聚体,两个PD-L1组成了一个管道式活性口袋,有利于结合小分子。在此模型下筛选出的小分子抑制剂具有较高的活性。本论文采用该方法对自有化合物库进行筛选,在100?M条件下,抑制率达到50%的化合物超过10个,在333?M条件下,化合物str5730可以达到完全抑制。细胞水平结合实验同样显示,在200?M下,str5730对PD-1/PD-L1结合有明显的抑制作用,且抑制率与化合物浓度之间呈依赖性关系,由此确定str5730为结构改造的先导化合物。在本课题研究期间,关于PD-1/PD-L1蛋白晶体的报道有2次重大突破,每一次更加精确的蛋白结合信息的报道,均为本论文的小分子结构设计带来更好的结果。利用GOLD、SYBYL、DS以及Autodock等计算机辅助设计软件,选择不同的条件,对自有库10000+个化合物,Maybridge商业库56000+个化合物以及FDA药物库进行分子对接、虚拟筛选及结合自由能评价,综合上述信息,选择部分化合物进行蛋白水平的活性筛选,而后在细胞水平上,对优选化合物进行活性评价,最后得到活性较好的小分子——str5730,可作为PD-1/PD-L1为靶的先导化合物。总之,针对PD-1/PD-L1通路,随着对蛋白晶体活性构象了解的不断加深,以及化合物数据库的不断丰富,立足计算机辅助药物设计的策略,将会发现更多的PD-1/PD-L1通路小分子抑制剂,以达到小分子免疫治疗的目的。