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三欣卡辛类化合物是日本科学家于1981年从波卓链霉菌Streptomycesbottropensis NRRL12051中分离得到，Maskey等人随后在2004年从一株海洋来源的链霉菌Streptomyces sp.B86523中也分离得到这类化合物。该家族化合物具有良好的生物活性，包括抗革兰氏阳性菌、抗疟及抗肿瘤活性。这类分子属于芳香聚酮类化合物，具有典型的蒽醌骨架，结构中含氧三元螺环是其重要的活性单元，可与DNA共价结合破坏其双链结构从而发挥其生物活性。该分子独特的起始单元，杂合的氧化、甲基化、糖基化及并环化后修饰的生物合成机制是我们课题研究的重点。 我们建立了三欣卡辛产生菌S.bottropensis稳定高产的液体发酵模式，利用大孔树脂HP20的高吸附性和稳定的培养基，提高三欣卡辛A的产量近百倍;通过各种柱层析的分离方法获得三欣卡辛A的标准品。通过同位素标记的三种乙酸钠喂养实验，确定了聚酮链的生物合成走向，推测出聚酮骨架碳由23个碳原子组成。利用Red/ET介导的PCR-targeting方法获得同源重组黏粒，通过属间接合转移成功获得双交换突变株，建立了该链霉菌体内遗传转移系统。建立链霉菌S.bottropensis高质量的基因文库，采用保守基因探针筛库和PCR筛库的方式共获得与三欣卡辛生物合成相关的三个黏粒cZM04-4、cZM05-09-2和cZM06-10-2，全序列102kb的有效基因信息中与三欣卡辛生物合成相关的约为66kb。体内敲除关键基因KS中断三欣卡辛的产生证实基因簇的正确性，同时根据上下游基因的体内敲除实验确定了基因簇的边界。 以获得的生物合成基因簇为基础，我们开展了系统性的体内遗传和体外生化相结合的功能研究，目前已有的进展包括: (1)通过基因簇中与骨架合成相关的14个基因的体内敲除实验，初步确定这些基因编码的蛋白在三欣卡辛生物合成中可能的作用;对环化酶及酮基还原酶的研究确定了三欣卡辛骨架碳的环合方式，获得了重要的中间体化合物Txn-41;通过对未知功能蛋白Txn44的体内功能研究，获得关键的芳香环未羟化产物Txn-44，证实Txn44属于氧化酶家族蛋白。 (2)根据同位素氨基酸标记喂养实验证实起始单元来自于异亮氨酸中的五碳单元;根据四个基因txn12，14,15,16的信息学分析及体内敲除实验，证实其在三欣卡辛合成中的重要性，推测出KSⅢ蛋白Txn14只具有转移功能;化学合成的前体化合物回补双基因缺失突变株恢复三欣卡辛A的产生证实七碳起始单元的合理性;利用链霉菌表达体系成功获得可溶蛋白Txn15，初步证实其具有异苹果酸合酶的催化类型;根据这些实验结果最终提出前体单元可能的生物合成途径。 (3)通过对糖基合成相关的13个基因的信息学分析，提出两个糖基单元的生物合成方式;在突变株中成功分到五个与糖基相关的化合物Txn-4-1，Txn-4-2，Txn-49，Txn-50-1，Txn-50-2;通过体内敲除实验确定了Txn50负责转移1号糖单元，获得了糖基转移酶Txn45，Txn50的可溶性蛋白。 (4)对三欣卡辛生物合成基因簇中四个细胞色素p450氧化酶的体内功能研究，分离并获得到四个有价值的中间体化合物(Txn-21，Txn-26-1，Txn-52-1，Txn-52-2)，表达并纯化了这四个氧化酶的重组蛋白。通过对三个氧甲基转移酶的体内功能研究，确定了其催化的相应位点;通过对其他后修饰基因的体内敲除实验结果分析，大致推测出这些基因在三欣卡辛生物合成中可能的功能。 (5)对抗性基因的初步研究及调控基因的体内敲除实验确定了这些基因在三欣卡辛生物合成中的重要性;确定基因簇中四种调节基因都属于正调控基因，证实正调控基因的多拷贝可以增加三欣卡辛的产量，这也为提高突变株中间体化合物的产量提供一种方法和手段。 基于上述三欣卡辛生物合成中大部分基因的体内功能及部分蛋白的体外纯化表达和活性测试，特别是11个关键中间体化合物的获得、异亮氨酸来源的前体单元的证实，我们提出一条三欣卡辛合理的生物合成途径。我们的结果首次揭示了一种全新的Ⅱ型聚酮合成中的起始单元，证实了聚酮合酶(KSⅢ)具有转移起始单元的功能，获得了一系列中间体化合物;这些不仅为生物合成途径的完善提供了依据，还将为我们深入研究杂合及并环化的后修饰机制提供丰富的材料和切入点。希望今后在突变株中获得更多中间体化合物，利用可溶性蛋白发现更多新颖机制的酶催化反应，通过组合生物合成方式获得结构丰富和具有良好生物活性的化合物。