论文部分内容阅读
水体中存在高浓度的重金属如镉、铅和铜等，这些重金属对生活在水体中的生物造成严重威胁。为从基因水平研究鱼类应答重金属胁迫的分子机理，筛选监测水体重金属污染的信标分子，本研究利用抑制消减杂交技术，构建了稀有鮈鲫肝脏组织经镉处理反应的正、反向抑制差减文库。利用PCR技术对文库进行筛选，并对阳性克隆进行分析，通过对正反向文库中部分表达序列标签(EST)进行序列测定，获得9条表达丰度较高的表达序列标签，平均长度为438 bp。主要包括热休克蛋白基因(HSP)、金属硫蛋白基因(MT)、阿朴脂蛋白C-Ⅰ(ApoC-Ⅰ)、核糖体蛋白s18(Rps18)及与渗透压力、盐度变化相关的基因，这些结果表明稀有鮈鲫经过重金属暴露后产生了复杂的应激、免疫反应。 通过SMART cDNA文库的构建并结合RACE(Rapid amplification of cDNAends)技术，从稀有鮈鲫的肝脏组织中克隆、鉴定出MT基因、ApoC-Ⅰ基因及Rps18基因的完全编码区序列。其中MT基因全长379 bp，3非翻译区127 bp，5非翻译区69 bp，编码区183 bp，可以编码60个氨基酸，已经提交Genbank，登录号为KC190024。Apoc-Ⅰ基因全长583bp，其中3非翻译区287个碱基，5非翻译区41个碱基，编码区255个碱基，编码84个氨基酸，已经提交Genbank，基因序列号为JX649103。Rps18基因全长525 bp，包括3非翻译区38 bp，5非翻译区28 bp，编码区459bp，编码152个氨基酸，已经提交Genbank，登录号为KF836434。 进一步利用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)对上述三个基因经过不同重金属（镉、铜、铅）胁迫后的表达时序进行研究。同时还对镉胁迫下，稀有鮈鲫不同性别及不同发育阶段鱼体内MT、ApoC-Ⅰ基因的表达情况进行研究，此外对不同浓度镉胁迫后，稀有鮈鲫肝脏组织中MT基因的表达情况也进行了研究。结果表明，铜在较低浓度下即可导致稀有鮈鲫的死亡，镉更容易影响基因的表达;镉、铅和铜暴露对MT主要表现为诱导作用，镉暴露对ApoC-Ⅰ基因主要表现为抑制作用，镉暴露对Rps18的影响主要集中在肝脏和肾脏组织;相较于受精卵来说幼鱼体内MT基因的表达更容易受到镉的影响;肝脏和肾脏组织中MT基因的表达存在性别差异;MT基因的表达量变化和镉浓度之间存在剂量依赖关系。 对镉暴露12h、24 h和48 h后的稀有鮈鲫不同组织中Cd元素的含量进行检测，结果表明Cd元素的积累主要发生在肝脏组织，肌肉组织中Cd元素的含量较低;鳃和肠组织中Cd元素的含量在实验过程中呈现逐渐增高的趋势;肝脏组织中Cd元素的含量与暴露浓度之间存在正相关关系。 本研究的结果将为稀有鮈鲫提供更加丰富的生物学资料，对稀有鮈鲫应答水体重金属污染的机理提供基础资料，同时也为筛选监测水体重金属污染的信标分子提供理论依据。