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几丁质酶普遍存在于各种动物、植物和微生物中,在医药、食品、环保、生防等许多领域显示出广阔的应用前景。国内外已经筛选出多种几丁质酶产生菌,并将其进行分离纯化。但只有部分在实际中得到应用,主要原因是菌株的产酶能力较低。因此筛选出产酶活力高、稳定的菌株是解决问题的一条重要途径。木霉菌作为一种生防菌,在生物防治中占有极其重要的地位,在其重寄生过程中产生的几丁质酶能够降解多种病原菌细胞壁。
本文从木霉菌Tr31产几丁质酶的确定、菌种的鉴定、几丁质酶的分离和酶学性质研究以及几丁质酶基因的克隆等几个方面进行了研究,结果如下:
通过透明圈法和DNS法来确定木霉菌Tr31是否产几丁质酶,结果发现:木霉菌Tr31在以胶体几丁质为唯一碳源的平板上生长,并没有透明圈的出现。通过DNS法检测后发现,发酵液变成了棕红色,说明菌株能产生几丁质酶。
在几丁质酶纯化过程中,首先对10000NMWC、50000NMWC、100000NMWC型号的超滤膜进行筛选,最终确定10000NMWC的超滤膜为最佳型号。通过硫酸铵沉淀试验,以沉淀比活力最大为依据,确定硫酸铵饱和度90％为最佳浓度。菌株发酵液经超滤、(NH4)2SO4沉淀,沉淀物经脱盐后得到粗酶液。将粗酶液进行SephadexG-100柱层析,分离出2个蛋白峰,其中仅峰2具几丁质酶活性。收集几丁质酶蛋白,对其进行SDS-PAGE电泳,得出该蛋白的分子量约为46kDa。该几丁质酶最适反应温度是50℃,最适反应pH值为5.0。几丁质酶的稳定性测定结果表明,酶液在30℃以下温度处理1h,酶性质稳定;在pH4-7条件下处理1h,活性基本不变。Ca2+、Mg2+、Ba2+等金属离子对酶活力有明显的激活作用,而Cu2+、Fe3+、Zn2+等对该酶有明显的抑制作用。
采用培养性状、形态特征观察法对木霉菌Tr31进行鉴定,发现该菌株与棘孢木霉的形态特征非常相似;进一步对该菌株的rDNA-ITS序列进行克隆并测序,发现该菌株的ITS序列与GenBank中已报道的棘孢木霉的ITS序列的同源性高达100％,证实该菌株为棘孢木霉Trichodermaasperellum。
根据几丁质酶基因序列保守区设计简并引物、再根据克隆到的几丁质酶基因片段序列设计特异性引物,运用RT-PCR、RACE-PCR、TAIL-PCR技术,从木霉菌Tr31中克隆出完整的几丁质酶基因。该基因cDNA全长1465bp,阅读框架（ORF）位于61～1335位核苷酸之间,编码424个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸。全长DNA序列为1635bp,包含3段内含子序列。该基因DNA和cDNA序列已在GenBank中注册,登录号分别为GU457410和GU457411。利用DNAMAN软件对木霉菌Tr31几丁质酶的分子量、等电点、疏水性和亲水性等挫质进行了分析,同时还预测了其二级结构,结果显示该蛋白的分子量为46.2478kDa,等电点为5.01。