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研究背景:哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它存在于哺乳动物的神经系统。mTOR可形成两种功能不同的蛋白质复合物。当它结合到Raptor蛋白，便形成mTOR的复合物1，它对雷帕霉素敏感，并控制蛋白质的翻译，参与形成持续性疼痛及其引起的疼痛敏感。 慢性痛持续性疼痛是一个重大的世界性公共卫生问题。它的特点是疼痛过敏，包括自发的持续或间歇性烧灼样疼痛，对疼痛刺激通常无害的刺激反应过强。其生物化学机制包括初级传入神经元的背根神经节（DRG）和中枢神经系统接受伤害刺激的突触上受体、酶和离子电压依赖通道的表达和功能的变化。mTOR的翻译和表达，在持续性疼痛的疼痛敏感机制中具有重要的作用。 有文献报道，生长因子可通过 PI3K、AKT来调控 mTOR，在大鼠皮肤的有髓感觉纤维亚群上发现了磷酸化的mTOR和它下游的一些翻译元件（p-70S6K和p-4E-BP1）。用肌电图证实应用mTOR抑制剂，可以降低损伤后机械痛敏相关的一些有髓伤害感受的敏感性；行为学结果表明，局部注射mTOR抑制剂雷帕霉素可以显著降低组织损伤引起的持续疼痛。同样，局部应用mTOR抑制剂可以降低损伤点周围的机械痛敏，降低外周神经损伤引起的长时机械痛敏。可见，mTOR通过调节局部蛋白质的合成而完成对外周传入纤维的伤害性敏感性的调节。由于外周感觉传入神经元属假单极神经元，以及轴突双向转运的存在，推测在脊髓可能同样存在mTOR依赖的局部蛋白质合成。但对于非疼痛状态下mTOR信号通路及其下游因子在脊髓和DRG的表达分布和细胞定位未见有报道。 研究发现，mTOR在神经系统参与调节非神经细胞的增殖，调节神经元的发育，调节突触的可塑性。在神经系统的某些疾病如帕金森病、阿尔茨海默病都常合并有mTOR通路的异常。mTOR被神经递质、营养因子、激素、缺血等多种物质激活后，通过其下游的效应器调节蛋白的翻译，并通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用。而雷帕霉素是其特异性抑制剂。对于鞘内给予雷帕霉素对CCI大鼠痛阈以及对mTOR信号通路的影响未见有报道。 近来的研究表明，mTOR和它下游的效应器也许会涉及神经性疼痛、炎症疼痛和癌痛。系统和局部注射雷帕霉素，一种选择性的mTOR抑制剂，已经证明能减缓机械刺激的超敏反应，无论超敏反应是由足底注射卡拉胶或辣椒素（炎症疼痛）、外周神经损伤（神经性疼痛）所诱导，还是由注射前列腺癌细胞进胫骨（骨癌疼痛）所诱导。虽然mTOR和S6K1在小的DRG神经元和脊髓后角神经元高度表达，但是在通常条件下，他们的激活（磷酸化）产物仅是低水平的表达。已有研究表明，足底注射卡拉胶或骨癌引起的损伤会导致大鼠脊髓后角p-mTOR和p-S6K1的增加，但是在DRG没有。然而，对mTOR在慢性炎症疼痛的所起的作用却知之甚少。而且，在脊髓和DRG的外周神经损伤后，是否mTOR和它的下游效应器会被激活还存在争议。 神经性疼痛慢性疼痛的生物学机制目前尚未完全明了，控制与治疗也并不完善。新开发的以受体靶标作用于周边C-感受器以降低神经性疼痛的药物已经证明作用甚微，靶向于A-伤害性感受器可用于治疗慢性疼痛。事实上，A-纤维敏感背角神经元的信号放大可能与神经病理性疼痛的二次痛觉过敏（损伤部位周围对伤害性刺激敏感性增加）和异常性疼痛（疼痛由于一个正常无害刺激）的两个临床特征有关。调节 A-疼痛感受器作用于 mTOR信号通路有助于提高外周损伤后疼痛的感觉灵敏度。研究显示，局部皮肤给予雷帕霉素，阻断激活的mTOR下游目标，缓解了局部炎症或神经性疼痛相关的机械性超敏反应。因此，作用于 mTOR信号通路可作为伤害感受器灵敏度的调节。如果靶向的mTOR信号通路具有潜在的治疗作用用于控制神经性疼痛慢性疼痛，而全身性用药的作用则尚不清楚。 针对mTOR信号通路在慢性疼痛中发挥的特殊作用，结合现有的临床应用的相关药物产生的抑制或影响通路传导的作用，在动物模型上获得减弱或消除慢性疼痛相关症状的效果。对mTOR信号通路的进一步深入研究，将有助于研发效力更强、副作用更小的新型靶向治疗慢性疼痛的药物。 本研究观察非疼痛状态下mTOR及其下游因子真核细胞起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）、p70核糖体S6蛋白激酶（p70S6K），以及其磷酸化形态在脊髓背角和背根神经节（DRG）和的表达和分布，以及细胞定位。观察经不同途径（鞘内给药、局部给药、全身性给药）抑制mTOR信号通路对神经性痛、炎性痛等不同疼痛模型诱导慢性痛的形成和维持以及对机械和冷痛热痛超敏反应的影响，探讨mTOR信号通路在慢性痛中的作用及其机制。 研究目的:观察mTOR及其下游因子真核细胞起始因子4E结合蛋白1/2（4E-BP1/2）、p70核糖体S6蛋白激酶（p70S6K），以及其磷酸化形态在脊髓背角和背根神经节（DRG）和的表达和分布。观察经不同途径（鞘内给药、局部给药、全身性给药）抑制mTOR信号通路对神经性痛、炎性痛等不同疼痛模型诱导慢性痛的形成和维持以及对机械和冷热痛超敏反应的影响，评价mTOR信号通路在慢性痛中的作用及其机制。 研究方法: （1）以逆转录-聚合酶链反应、Western blot确定非疼痛状态下mTOR及其下游因子4E-BP1/2和p70S6K及其磷酸化形式在背根神经节和背角的表达。免疫组化染色确定mTOR、4E-BP1和p70S6K及其磷酸化形式在背根神经节和背角的定位，并定量分析。 （2）经行为学检测、免疫组化染色、免疫印迹方法分析鞘内给予 mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素对CCI术后大鼠机械痛阈和热痛阈以及脊髓背角胶质细胞的影响。 （3）经行为学检测、免疫组化染色、免疫印迹方法分析完全弗氏佐剂(complete Freunds adjuvant，CFA)足底注射导致的慢性炎症疼痛过程中和在脊神经结扎(SNL)导致的神经性疼痛过程中，mTOR和S6K1在大鼠的DRG和脊髓的表达和激活。 （4）经行为学检测、免疫组化染色、免疫印迹方法分析西罗莫司脂化（CCI-779）足底局部和全身性给药对神经病理性疼痛的影响，以及观察Torin1全身性给药对神经病理性疼痛的影响。 结果: （1）mTOR、4E-BP1和p70S6K分布在整个脊髓背角和DRG，特别是在脊髓背角的外层，而磷酸化形式在脊髓背角和DRG表达都非常低，没有检测到。在脊髓背角，mTOR、p70S6K和4E-BP1表达于神经元细胞，在星形胶质细胞和小胶质细胞没有表达。在DRG，mTOR和p70S6K表达于神经元细胞，26.1％（±3.2％）呈mTOR表达阳性，19.1％（±1.9％）呈p70S6K表达阳性；4E-BP1则表达于卫星胶质细胞。 （2）与对照组相比，CCI组机械痛阈和热痛阈从CCI第4天开始下降；前后给药对照剂组与CCI组相比无明显差异。与CCI组相比，前给药组痛阈从CCI第4天开始上升，直到第14天都有明显差异。与CCI组相比，后给药组痛阈从CCI第8天开始上升，直到第14天都有明显差异。与正常组比较，CCI组、前、后对照剂组损伤侧脊髓背角GFAP阳性面积与阳性区平均光密度均有明增加。与CCI组比较，前、后给药组损伤侧GFAP阳性面积与阳性区平均光密度均有明显降低。 （3）CFA注射产生机械刺激的超敏反应，缩爪阈PWT减少；热疼痛的超敏反应，缩爪潜伏期 PWL减少。患侧超敏反应在CFA注射后的2h出现，约1天后达高峰值，并且持续7天。mTOR和S6K1的激活水平随着时间的推移而显著增加。和对照组相比，CFA注射后2h，p-mTOR和p-S6K1显著增加(p-mTOR：2.58±0.52倍于对照组；p-S6K1：2.49±0.03倍于对照组；P<0.05)，并且持续至少7天。鞘内注射雷帕霉素大鼠的同侧的PWT增加了5.25倍，相比于空白对照的大鼠，P<0.01；PWL(3.59±0.26 s)显著减少，相比于基础的PWL(10.28±0.60s)，P<0.01。鞘内注射雷帕霉素大鼠的同侧的PWL增加了1.6倍，P<0.05。 （4）在皮肤和背根神经节的有髓初级传入神经纤维有磷酸化 mTOR（p-mTOR）表达，mTOR和其磷酸化（P-mTOR）形式与传入感觉神经的标志物PGB共染，并且表达于周围皮肤组织的非神经元细胞，表明其广泛表达于初级传入感觉神经纤维亚群。P-mTOR连续表达于轴突，真皮层内P-mTOR阳性轴突可达数百微米。足底注射CCI-779降低神经病理性痛模型的机械痛和冷痛阈，全身性给予CCI-779降低神经性疼痛和炎症性疼痛小鼠对机械和冷刺激的反应。 结论: （1）在非疼痛状态下，mTOR及其下游因子p70S6K和4E-BP1/2在脊髓背角和DRG表达丰富，而它们的磷酸化活化形式表达非常低。 （2）鞘内给予雷帕霉素抑制mTOR信号通路可以降低神经病理性痛模型CCI大鼠的机械痛和热痛超敏反应，并抑制脊髓背角胶质细胞的激活。 （3）在大鼠足底注射CFA诱导的外周炎症激活了mTOR信号通路，mTOR及其下游因子磷酸化在脊髓和DRG的表达增加，鞘内注射雷帕霉素可以抑制CFA诱导的疼痛超敏反应。 （4）足底注射CCI-779降低神经病理性痛模型的机械痛和冷痛阈，全身性给予CCI-779或Torin1可以抑制脊髓和DRG的mTOR信号通路活化，降低神经性疼痛和炎症性疼痛小鼠对机械和冷刺激的反应，并且可以抑制踝关节注射辣椒素诱导的继发性的超敏反应。