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神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一,其生理作用十分广泛：它是神经细胞生长和修复所必需的活性物质；它在神经系统、免疫系统和内分泌系统的相互作用中有着重要调节功能；而且许多神经退变性疾病的发生也与NGF有关。
NGF的组织来源有限,而且成本高,产量低,不能满足我们的需求。因此利用基因工程方法获得有生物学活性的hNGF制品,对其基础理论研究和临床应用都具有重要的意义。
由于至今发现的绝大部分是以含前导肽的前体形式合成的蛋白质,而其前导肽据推测具有帮助NGF正确折叠的作用,所以本研究选取含前导肽的人NGF基因(pproNGF)在大肠杆菌中进行了表达,并且就如何提高重组菌株目的蛋白的表达及proNGF的性质进行了一系列研究。
本实验采用分子克隆技术,PCR扩增技术将proNGF基因克隆到pBS-T载体,分析鉴定后把克隆的proNGF基因插入到表达载体pET15b中构建重组表达质粒,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。通过对转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS的培养特性和蛋白表达进行研究,确定了重组菌株最佳表达proNGF的条件。在获得的最佳条件下由IPTG诱导重组菌株表达目的蛋白,SDS-PAGE检测表明目的蛋白表达后以包涵体形式存在,运用Western-blotting方法鉴定表达产物的免疫学活性。在此基础上,通过镍柱亲合层析得到高纯度的包涵体,经肠激酶切割后获得proNGF蛋白,用Bradford法测定所得蛋白质的浓度。将纯化后的proNGF在氧化还原环境下进行透析复性,RP-HPTC法对复性结果进行检测,通过与标样保留时间的对比确定复性的成份。最后运用PC12细胞对复性后的蛋白进行生物学活性鉴定。
本实验通过对重组菌株的培养特性和表达的研究,确定了重组菌株最佳表达proNGF的条件,获得了大量的表达蛋白,为实现大规模生产NGF创造了条件。同时,在活体试验中证明复性后的proNGF具有很高的生物学活性,由于NGF属于神经营养因子家族,它们有高度同源性,所以proNGF的复性方法有可能适用于神经营养因子家族的其他成员。研究的结果对NGF生物特性的研究及其在临床上的推广应用也有重要的意义。