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干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,它们为临床治疗和基础研究提供了丰富的细胞来源和有力的研究工具。
目的:经hESCs体内分化途径获取MSCs并用其作为饲养层来支持hESCs的体外培养。
方法:将约1×107hESCs注射入重症联合免疫缺陷小鼠(SCID)体内,经过5-10周,解剖获取畸胎瘤组织并剪碎和胰酶消化,采用间充质干细胞专用培养基(TM)培养和扩增MSCs,对获取的MSCs进行成骨诱导、成脂诱导和流式细胞术检测细胞表面标记。用10μg/mL,丝裂霉素(MMC)处理MSCs,并作为hESCs饲养层,检测在该饲养层上培养的hESCs的生物学特性:用免疫荧光染色检测其表面标志、反转录PCR(RT-PCR)检测其特异性转录因子、G显带技术检测核型、体内外分化实验等检测hESCs生物学功能。
结果:hESCs在SCID-beige小鼠体内5-10周可形成畸胎瘤,经MesencultTM培养可从畸胎瘤中获得纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC特性的细胞群:CD34和CD45阴性,CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90阳性,经诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。将hESCs在MSCs饲养层细胞上传代培养10代以上,hESCs依然具有正常的细胞形态,RT-PCR证实其特异转录因子Oct4、Nanog的表达,干细胞表面标记SSEA-1显示为阴性,SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81显示为阳性,碱性磷酸酶染色显示为阳性,并且核型正常。体外EB分化能力和体内畸胎瘤形成支持其全能性。
结论:
①从hESCs畸胎瘤中分离到MSCs;
②来源于hESCs本身的MSCs作为饲养层支持人胚胎干细胞生长并维持其未分化状态。