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RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)是近年发展起来的一项基因调控技术。它能特异性地识别目标基因，并阻抑其转录和表达。蛋白激酶CK2α和α亚基基因为原癌基因，对恶性肿瘤细胞的发生发展具有重要作用，而β亚基为CK2的调节亚基，对蛋白激酶CK2具有重要的调节作用。本文将采用以质粒为载体的RNAi技术，剔降人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞中蛋白激酶CK2三个亚基基因，抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。
方法：借助网上RNAi设计工具寻找蛋白激酶CK2三个亚基基因上开放表达框架中可能的位点，经过BLAST检查确定与其它基因不存在同源性，命名为pCMV-CK2α1～3，pCMV-CK2βA～C和pCMV-CK2αA、D。人工合成8对正反义脱氧寡核苷酸链，退火，定向克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达质粒载体pCMV中。DNA测序确定重组结果。抽提和纯化已鉴定的质粒，根据紫外分光光度法确定重组质粒的浓度和纯度。利用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将siRNA质粒和荧光表达蛋白质粒共转染至CNE-2Z细胞中，通过观察荧光蛋白在细胞中是否表达，分析质粒的转染效率。以MTT法检测细胞生长增殖的抑制情况，以半定量RT-PCR法筛选有效的靶序列，检测蛋白激酶CK2活性变化来检验siRNA质粒的RNAi效应。流式细胞术检测细胞周期的变化和细胞凋亡，荧光显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化。
结果：各对DNA退火链均按正确顺序插入pCMV质粒，DNA测序结果表明各重组质粒的序列符合预期要求。抽提和纯化后，各质粒的纯度和浓度均通过测定。经LipofectamineTM2000共转染后，质粒的转染率最高在80％左右，而且转染效率在0～2.4nmol/L剂量范围内随浓度的增加而提高。半定量RT-PCR结果表明，各siRNA质粒转染组CK2各亚基mRNA转录水平有不同程度的下调，下调水平介于27.10％～90.35％。与其它质粒转染组比较，pCMV-CK2α3、pCMV-CK2βA和pCMV-CK2αA质粒转染组的结果差别有统计学意义，而各对照组内CK2mRNA转录水平无明显改变。MTT法表明细胞生长、增殖受抑。应用同位素技术检测蛋白激酶CK2活性明显降低。流式细胞术显示pCMV-CK2α3可以使细胞周期中G1期明显增高，pCMV-CK2αA可使细胞周期中S期明显增高。流式细胞术显示pCMV-CK2α3和pCMV-CK2βA质粒转染组可诱导CNE-2Z细胞凋亡。荧光显微镜下观察肿瘤细胞发现pCMV-CK2α3、pCMV-CK2βA和pCMV-CK2αA质粒转染组细胞出现典型的凋亡形态学变化：胞体缩小、胞浆浓缩、核染色质聚集、核固缩、核碎裂、还可见凋亡小体。
结论：成功构建了3种针对人蛋白激酶CK2α亚基基因、3种针对人蛋白激酶CK2β亚基基因和2种针对人蛋白激酶CK2α亚基基因的siRNA真核表达质粒。
LipofectamineTM2000在CNE-2Z细胞中对siRNA质粒的瞬时转染效率较高，其转染效率具有剂量依赖性。构建的含siRNA表达框架质粒能特异且有效下调CK2基因的表达，但不同pCMV-CK2质粒特异性地下调CK2基因表达的能力不同。其中pCMV-CK2α3、pCMV-CK2βA和pCMV-CK2αA质粒沉默能力最好，并能在转染后有效抑制恶性肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。本实验研究结果显示RNA干扰技术是进行肿瘤基因治疗研究的有效工具。