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漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,能催化氧化胺类、酚类物质等多种不同底物的反应,在环境、食品、医药等行业获得广泛应用。采用单因素法选择合适的碳源、氮源及初步确定合适的金针菇LP03液体培养产漆酶的条件,并通过响应面法对培养基及培养条件进行优化以提高漆酶产量。运用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法测定漆酶活力,并确定其最佳反应条件。利用发酵罐进行扩大培养,然后采用DEAE Sephadex A-25和Sepharose4B对发酵液中的漆酶进行分离提纯。主要研究内容和结果如下: (1)在液体培养条件下,考察了碳源、氮源、Cu2+以及培养条件等因素对金针菇产漆酶的影响。结果表明,以3％玉米粉为碳源,1%蛋白胨为氮源,添加1mmol/L的硫酸铜,初始pH值6.0、装液量200 mL/500 mL三角瓶、28℃、160 r/min条件下培养,漆酶产量最高,菌株产酶活力为1813.52±5.59 U/L。 (2)利用Plackett-Burman实验设计得到影响金针菇LP03产漆酶的显著性因素,蛋白胨、葡萄糖、MgSO4·7H2O浓度、pH值及装液量对漆酶的生产影响显著,结合响应面方法中的中心组合实验设计对五个因素进行优化以提高漆酶产量,最佳实验条件为蛋白胨1.75%,葡萄糖0.46%,MgSO4·7H2O0.0798%,pH6.11,装液量222.4mL,在此条件下获得最高酶活为2920.33±42U/L,与基础培养基相比酶活提高了4.85倍。 (3)采用稀硫酸、稀醋酸以及水对秸秆进行水解,稀硫酸的水解效果较好。采用单因素实验以及正交实验对稀硫酸水解条件进行了优化,结果表明水解时间对水解影响最大。最佳水解条件为:水解时间1h、稀硫酸浓度5%、固液比1:15、温度120℃,并利用水解液作为发酵液进行金针菇 LP03深层液体发酵产漆酶,获得最高酶活为1410.3 U/L。 (4)在液体培养条件下,考察了酚类、胺类、氨基及表面活性剂等外源刺激物对金针菇LP03漆酶分泌的影响。结果表明,不同的刺激物对菌体生长及产酶有不同程度的影响。添加愈创木酚、2,4-二硝基酚和单宁酸对金针菇LP03的漆酶分泌有明显的诱导作用,漆酶最高酶活比对照组分别提高了17%、16.6%和20.4%。苯酚、间苯二酚、氨基酸及VB1对漆酶分泌无明显诱导作用,而DMP、焦性没食子酸及表面活性剂对漆酶的分泌有抑制作用。酚类物质对菌体生长有明显的促进作用,而其他物质对菌体生长无明显影响。 (5)通过对金针菇LP03液体发酵的粗酶液进行离心、硫酸铵盐析、透析浓缩、DEAE Sephadex A-25离子交换层析以及Sepharose4B分子筛层析等分离纯化操作,初步得到了四种纯度较高的漆酶组分。酶活总回收率为17.42%,纯度最高提高了12.45倍。