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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第三位。由于缺少有效的治疗药物,肝癌目前5年生存率还很低。已有的研究报道,肿瘤干细胞在恶性肿瘤的复发、转移中发挥着关键性作用。因此,寻找在肝癌干细胞生长转移过程中发挥重要功能的特异基因和／或蛋白,为靶向治疗肝癌干细胞提供有价值的靶标,这将成为治疗肝癌的新希望。因此,本研究从原发性肝细胞肝癌患者新鲜肿瘤组织中分离、培养肿瘤干细胞。利用大容量功能性单抗库技术,筛选、鉴定能识别并且对肝癌干细胞样细胞有抑制作用的功能性单抗,以期为靶向肿瘤干细胞治疗肝癌的新策略提供有应用潜力的功能性单抗和分子靶标。采用酶消化法以原代结合短暂传代培养从人肝癌组织中分离含人肝癌干细胞样细胞hLCSLCs (human Liver cancer stem cell-like cells, hLCSLCs)的连续传代细胞。分别加入肝素、白蛋白、氢化可的松筛选适用于hLCSLCs的无血清悬浮成球培养的培养基。以流式细胞术检测hLCSLCs和由无血清悬浮成球培养所获得的成球细胞中旁群(SP)细胞CD133及CD90等相关标志物的表达。裸鼠成瘤实验检测SP细胞及无血清悬浮成球细胞的致瘤能力。以hLCSLCs免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,采用甲基纤维素选择培养液培养,制备大容量抗肝癌细胞的单克隆抗体库。采用细胞免疫荧光双染色法,筛选出识别肝癌干细胞标志物CD133阳性细胞的单克隆抗体。ELISA测定单克隆抗体的类和亚类。采用无血清悬浮培养法、增殖实验等筛选抑制肝癌干细胞无血清成球和抑制细胞增殖的功能性单克隆抗体。Western Blot鉴定单抗所识别的功能性抗原蛋白。纯化抗体,采用细胞免疫荧光检测其所识别的抗原蛋白,进行亚细胞定位；应用抗体15B7检测分析其所识别抗原基因体外对hLCSLCs增殖、侵袭迁移功能、细胞周期及凋亡的影响。应用纯化后的抗体进行体内抑瘤实验,评估抗体对hLCSLCs的影响。分离鉴定其功能性抗原蛋白,运用免疫亲和层析及MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定获得的肝癌干细胞相关的功能基因。成功地从人肝癌组织分离获得hLCSLCs,其SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为0.9%、0.8%和12.7%,裸鼠皮下接种2000个SP细胞,成瘤率为100%。含有肝素的无血清培养基更适于hLCSLCs的成球培养,所获成球细胞中SP、CD133+和CD90+细胞含量分别为4.6%、9.7%和48%,接种10 000个成球细胞即可全部成瘤。以上结果表明hLCSLCs细胞中含有高比例的肝癌干细胞,且含有肝素的培养基可以富集肿瘤干细胞。细胞融合后获得2964株杂交瘤克隆,在能与hLCSLCs反应的237株克隆中有116株单抗能与hLCSLCs的细胞膜结合。免疫荧光双染色实验筛选分选后的SP细胞鉴定出33株能识别CD133阳性的肝癌干细胞单抗。ELISA检测发现,33株单抗有不同的重链类、亚类,包括IgM型、IgA型、IgG1型和IgG3型,表明我们所建立的抗肝癌单克隆抗体库具有类型上的多样性。采用无血清悬浮培养细胞球成球实验,从33株单克隆抗体中筛选获得了14株对hLCSLCs在无血清悬浮培养所形成的球大小和成球个数有抑制作用的单抗,抑制率约为2%-62%；其中抑制率达10%以上的有8株。另有6株对hLCSLCs-SP及hLCSLCs细胞球细胞有明显的抑制增殖作用,抑制率均大于10%。裸鼠皮下接种2×104个15D2、3G7单抗阳性的hLCSLCs,成瘤率为100%。活细胞免疫荧光结果显示15B7抗原定位在肝癌细胞膜上。肝癌干细胞相关单抗15B7在hLCSLCs、hLCSLCs-SP、hLCSLCs细胞球细胞体外培养生长增殖抑制率分别为13.8%、7.1%、9.3%；15B7抗体对侵袭的抑制率为30.9%(p<0.05)；对迁移的抑制率为15.7%(p>0.05)。细胞周期检测发现hLCSLCs发生G1期阻滞,致使细胞增殖减慢,并出现凋亡。15b7单抗能显著抑制hLCSLCs移植瘤生长,高、中、低剂量的抑制率分别为59.2%、60.5%和8.4%。绘制生存期曲线发现在体内15B7单抗治疗小鼠可明显延长其生存期。免疫组化检测发现,治疗组可诱导cyclinD1上调表达,影响细胞周期进程；caspase3表达明显升高,表明抗体可以诱导凋亡。通过这一系列的作用,从而抑制hLCSLCs在体内外的快速增殖和生长,进一步证明了肝癌干细胞相关抗体15B7为功能性单抗。经过MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定,15B7所识别的抗原蛋白为POTE-actin.成功建立了一种人肝癌组织中肿瘤干细胞样细胞分离培养方法,添加肝素的无血清悬浮成球培养或通过分选SP细胞可有效富集肝癌干细胞样细胞。建立了大容量抗人原发性肝癌干细胞细胞的单克隆抗体库,获得了2株可能特异性抑制肝癌干细胞生长的功能性单抗；至少得到2株所识别的阳性细胞可能为肝癌干细胞的单克隆抗体；初步筛选鉴定了一株显著抑制肝癌干细胞无血清成球、增殖的单抗15B7及其识别的抗原分子,并初步研究了其分子机理,为筛选肝癌靶向治疗剂及靶标提供了一种潜在的新方法。