重组猪生长激素PGH的高效表达、纯化及活性鉴定

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动物生长发育调控是一个高度复杂的生理过程,受多种因素如体液、神经、遗传、环境及营养等的影响。下丘脑接受体内外的信息来调节垂体生长激素的分泌如生长激素释放激素和生长抑素。GH的运输是通过与生长激素结合蛋白结合而实现的,其与靶器官上的生长激素受体结合,促使类胰岛素生长因子的产生并进入血液循环,再通过其结合蛋白转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。  猪生长激素(porcine growth hormone,PGH)是一种由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单一肽链蛋白质类激素(190-191aa)。PGH为蛋白质类激素制品,不同于固醇类激素和人工合成的生长调节物质(如瘦肉精),不在动物体内残留。注射外源PGH能显著提高猪的生长速率,降低单位饲料的消耗量,促进肌肉的生长和减少脂肪合成。  本研究根据大肠杆菌的偏爱密码子,优化PGH的密码子,得到优化后的猪生长激素的核苷酸序列,体外合成了不含信号肽的猪生长激素基因,大小为573bp。设计带酶切位点的特异性引物从pUC57克隆载体上扩增得到PGH基因,并且成功构建了重组表达质粒pET28a+-PGH。将其转入BL21感受态细胞,在0.5M IPTG作用下37℃诱导6小时。PGH在体外获得了高效的表达,然而得到的表达产物大都以包涵体的形式存在。为了获得可溶性的PGH,采用了两种不同的方法对包涵体进行变复性实验,通常采用的方法是利用8M尿素溶解包涵体,利用稀释复性的方法使尿素的浓度降低至2M,从而使其复性。另一种新颖的方法为,在高pH(pH12)的环境中,利用2M尿素溶解包涵体,随后改变pH,使缓冲液pH达到8.5。利用pH的变化达到复性目的。理论上讲,如果包涵体能够保留其完整的二级结构,则可以大幅度提高复性效率,然而利用8M尿素溶解包涵体会破坏其二级结构。本研究利用这种方法进行PGH包涵体的变复性研究,得到正确复性的重组猪生长激素,其复性效率可达30%以上。重要的是利用该方法可以一步得到纯度较高的目的蛋白,而且产量高,有利于下一步的工业化生产。  为了检测复性得到的PGH的活性,本研究用superdex-75凝胶柱对复性后的PGH进行了进一步的纯化,将纯化得到的蛋白质稀释成不同的浓度,分别作用于HEK293T细胞,利用细胞毒性实验MTT比色法检测其对细胞的增殖的影响。研究结果表明,随着PGH浓度的增加,细胞的增殖速率总体呈上升趋势,作用时间为8小时的时候,PGH对细胞的作用较明显,因而初步认定复性后的重组PGH具有促细胞生长的活性。
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