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D-海因酶因其能够将5-单替代海因及其衍生物水解开环，产生N-氨甲酰-D-氨基酸，继而在化学法或酶法的作用下继续水解，获得重要的手性中间体——D-氨基酸，而受到人们的广泛关注。与其它制备方法相比，酶法生产D-氨基酸具有产物光学特异性好、环境污染小、生产成本低等显著优点，目前已成为全球D-氨基酸生产的主流方法之一。 利用从本实验室Pseudomonas putida YZ-II6菌株中得到的D-海因酶基因，用PCR法在3-端区进行了截短突变和替代突变。重组子在E.coli中获得表达并纯化突变酶，随后对突变酶的寡聚体形式和理化性质进行了一系列研究。然后，在重组海因酶的培养和纯化过程中添加Co2+，得到Co2+-替代海因酶。后者酶活性大大提高，是重组酶活性的7倍，这为D-氨基酸的生物转化提供了一个新酶源。之后，又用DPA、DEPC和ZnCl2分别处理重组海因酶，再结合ICP-AES金属离子分析，圆二色和荧光发射光谱以及酶活性测定等手段，推论出该海因酶有α、β两个金属结合位点，它们各自担负不同功能。最后，用海藻酸法将工程菌pE-hdt/E.coli BL21固定化。固定化细胞在pH和热稳定性以及底物谱等方面均有所改善，转化底物对羟基苯海因时，半衰期达32天。 1、D-海因酶C-端区的突变 利用PCR定点突变技术构建了P.putida YZ-II6的D-海因酶基因3-端的各种重组子，并表达了D-海因酶(P479)C端区1-5个氨基酸截短的突变蛋白(P478、P477、P476、P475和P474)，并将该酶C-末端带正电荷的Arg替换为不带电荷的Ala(R479A)和带负电荷的Asp(R479D)。SDS-PAGE分析以及酶活性测定结果表明，四个突变体（P478、P477、P476和P475）和一个替代突变体(R479D)为可溶性表达，并能保留绝大部分活性。相反，其它两个突变体P474和R479A则完全丧失酶活性，均以包涵体形式存在。分子排阻层析实验表明重组酶P479的保留时间为11.41 mL，为二聚体;而可溶性突变酶为12.25 mL，以单体形式存在。以上结果至少说明(1):该海因酶C-末端区的可变性是有限的，过多的截短会引起酶结构变化和活性丧失。 (2):重组海因酶以二聚体形式存在，该酶C-末端479位的Arg正电荷是亚基二聚化的关键因素。(3):该酶的最小活性单位是单体海因酶。与二聚体重组酶相比单体突变酶的理化性质也有所不同。例如:(1)在酸性和碱性条件下，突变酶的pH稳定性明显高于重组酶，剩余活性约是重组酶相应情况下的两倍。(2)突变酶的热稳定性明显降低，60℃处理10 min后单体突变酶剩余活性仅为二体重组酶的1/2-1/3，说明二聚体形式可提高海因酶的热稳定性。(3) Zn2+和Mn2+对单体突变酶和二体重组酶活性影响差别很大。1 mmol/L Zn2+处理后，重组酶尚能保留60％的活性，而突变酶仅剩余不到10％的活性;1mmol/L Mn2+仅能提升重组酶1倍的活性，相比之下突变酶能增加3-4倍的活性，说明海因酶C-端的突变和亚基的解离能影响Zn2+和Mn2+对该酶的抑制或激活作用。 2、Co2+-替代海因酶的制备及酶学特征 用重组pE-hdt/E.coli细胞生产Co2+-D-海因酶（Co2+-HDT），表达时在培养基中添加40μmol/L的Co2+，37℃培养10小时，表达产物经Q-Sepharose阴离子交换剂和Phenyl-Sepharose疏水层析，可获得电泳纯的Co2+-HDT。该酶的比活性比HDT高约6倍，达21.8 U/mg。可见光谱分析表明，Co2+-替代酶在498 nm和568 nm处有两个吸收峰，摩尔消光系数分别为ε498=196 L/mol·cm和ε568=179 L/mol·cm，这是五配位Co2+-海因酶络合物的特征性吸收峰。用ICP-AES法测定纯酶中金属离子含量时，HDT每摩尔亚基含0.93摩尔Zn2+和0.04摩尔Co2+，而Co2+-HDT中每摩尔亚基中含0.17摩尔Zn2+和0.89摩尔Co2+。这些结果表明HDT中绝大多数的Zn2+已被Co2+所替代。Co2+-HDT的pH稳定性亦有所改变，在酸性侧Co2+-HDT稳定性显著高于HDT，而碱性侧Co2+-HDT低于HDT。说明Co2+的替代能改变该酶活性中心的pK值，从而改变了海因酶分子的pH稳定性。此外，基本动力学常数、热稳定性，金属螯合剂EDTA的影响等方面，HDT和Co2+-HDT也略有差异。 3、D-海因酶分子中Zn2+的定量和功能分析 用DPA、ZnCl2和DEPC分别处理重组海因酶，获得了去锌海因酶(Apo-HDT)、加锌海因酶(Zn-HDT)和DEPC-修饰酶(DEPC-HDT)三种不同形式的海因酶分子。活性测定结果表明Zn-HDT与HDT具有相似的酶活性，而Apo-HDT和DEPC-HDT活性则完全丧失。用ICP-AES法测定上述酶的锌离子含量，HDT、Zn-HDT、DEPC-HDT和Apo-HDT每摩尔亚基分别含有0.95、2.17、0.57、0.04摩尔的Zn2+。说明该酶可能含有两个Zn2+结合位点（α和β位点）。在通常条件下，酶分子仅能结合一个活性Zn2+（α位点），组氨酸修饰剂DEPC和金属螯合剂DPA都能够引起该Zn2+的丢失，导致部分或全部活性的丧失;而过量的Zn2+处理后，该酶还能结合第二个可能与活性无关的结构Zn2+（β位点）。采用Zinco或PAR竞争结合法测定β位点结合Zn2+的能力，结果表明β位点空位时表观结合常数为5×104 L mol-1，而结合Zn2+后表观结合常数增加到5×1012 L mol-1，这暗示β位点结合Zn2+后能引起海因酶结构的变化，可能导致该位点Zn2+结合能力的增强。Zn2+对海因酶的圆二色、荧光发射光谱和热稳定性的影响也证实了这一点。 4、产海因酶工程菌的固定化 为了重复利用产海因酶工程菌细胞，提高转化效率，降低生产成本，采用海藻酸钙法进行细胞固定化。固定化条件为:2.5％海藻酸钠5 g与30 mL工程菌发酵液的菌体均匀混合，并适当控制液滴大小，滴入3％的氯化钙溶液中，冷却固化3.5小时左右。固定化细胞热稳定性明显增强，在55℃时酶活性基本保持不变，至65℃时还能保留70％的活性。固定化细胞对底物海因和苯海因的催化能力虽略有下降，但转化底物对羟基苯海因的能力相当于游离细胞的两倍，半衰期达32天（次）。高效液相色谱分析表明，固定化细胞催化水解底物对羟基苯海因能在4小时内基本完成，转化率大于90％。