论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种以仔猪和育成猪呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍为主要特征的传染病,对全球养猪业危害较为严重。2006年在我国全国范围内爆发以高热、高发病率和高死亡率为主要特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)给我国养猪业造成了巨大损失,此后HP-PRRSV持续存在于我国猪群中。2013年初上海某猪场保育猪群出现高热、呼吸障碍等临床表现,导致大部分发病猪死亡。为了确定此次猪群中爆发疫病的病原,本研究从发病猪群中随机采集了15份血液样品,利用RT-PCR方法对本次疫病病原进行了检测。结果显示,有11份临床样品均呈现PRRSV阳性,且PCR条带与高致病性PRRSV对照条带大小相一致。随后从阳性样品中选取编号为SHxx13/2013的样品在Marc-145细胞中进行病毒的分离与鉴定,获得的分离病毒经RT-PCR和IFA鉴定为PRRSV,命名为SHxx13/2013。SHxx13/2013株在Marc-145上细胞病变特征与高致病性PRRSV强毒HuN4株一致,其蚀斑形态和生长特性与强毒HuN4株相似。对SHxx13/2013株进行全基因组测序,结果显示SHxx13/2013株全长基因组为15319bp, Nsp2编码区在第482位和第534-562位氨基酸处存在2段共30个氨基酸的不连续缺失,与HP-PRRSV的分子特征一致。遗传演化分析结果显不SHxx13/2013与国内近期流行的HP-PRRSV全基因组同源性较高,与欧洲经典毒株LV全基因度同源性较低,证实新分离的PRRSV SHxx13/2013株属于北美型HP-PRRSV毒株。为了确定新分离的SHxx13/2013株对猪的致病性,我们在动物体内对SHxx13/2013株的致病性进行了分析。选取10头PRRSV、猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、猪圆环病毒(PorcineCireovirus, PCV)和猪细小病毒(porcineparvovirus, PPV)抗原阴性,PRRSV抗体阴性的健康的30日龄仔猪,随机分为两组,命名为S组和C组,每组5头。S组以3×104TCID5o/头份剂量接种2mL SHxx13/2013病毒液,C组接种2mL DMEM。攻毒后每日测量体温、采集鼻拭子、记录临床症状,每隔7天采集血清。结果显示攻毒后S组猪发热,并出现精神沉郁、食欲废绝、皮毛苍白粗糙、气喘咳嗽、颤栗等临床症状,最终死亡4头。C组体温正常,无临床症状。血清和鼻拭子中病毒载量结果显示,S组猪血清和鼻拭子内均能检测到PRRSV病毒,C组则无法检测到PRRSV病毒。剖检和组织病理学观察结果显示,S组猪体内各组织器官有明显损伤,C组则全部正常。用RT-PCR方法对S组死亡猪血清进行其他病原检测显示血清中PRRSV抗原呈阳性,其他病毒抗原CSFV.PCV.PRV和PEDV等均为阴性。结果证实新分离的PRRSV SHxx13/2013株感染后能够引发仔猪产生高热以及呼吸障碍等临床症状,并能够导致仔猪死亡,具有较强的致病性,属于高致病性PRRSV分离株,进一步证实2013年初上海某猪场暴发的疫情为HP-PRRSV感染所致。PRRSV的毒力变化给我国的养猪业带来了极大困扰,对PRRSV由弱至强的分子基础进行研究有助于揭示PRRSV的致病机理。本研究在HP-PRRSV HuN4致弱疫苗毒HuN-F112株感染性克隆的基础上,利用反向遗传操作技术分别将PRRSV HuN4强毒的Nsp1-2、Nsp3-8、ORF2-4、ORF5-6编码序列替换到弱毒骨架上,构建出四个全长感染性克隆质粒,转染后获得拯救病毒,分别命名为LAF Nsp1-2H、LAF Nsp3-8H、LAF ORF2-4H、LAF ORF5-6H。拯救的重组病毒测序和免疫荧光鉴定证明均为所设计的预期嵌合病毒。四株嵌合病毒LAF Nsp1-2H、LAF Nsp3-8H、 LAF ORF2-4H、LAF ORF5-6H在Marc-145细胞的病毒滴度分别为106.37TCID50/0.1mL106.50TCID50/0.1mL、105.8OTCID50/0.1mL、105.90TCID50/0.1mL。在Marc-145上绘制四株嵌合病毒的生长曲线,结果表明嵌合病毒LAF Nspl-2H和LAF ORF2-4H在Marc-145上的生长曲线低于其母源病毒HuN4-F112,提示病毒的Nsp1-2和ORF2-4编码区可能与病毒在Marc-145上的细胞适应性密切相关。