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无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）是革兰阳性，β溶血的链状球菌。因其兰氏分群为B群，人医临床常以B群链球菌相称(groupBstreptococci，GBS)。该菌的感染谱较广，不仅可引起人类新生儿败血症和脑膜炎，也是牛乳腺炎的主要病原之一。同时，发现该菌还可感染鱼类并导致其发病死亡。2009年以来，我国南方罗非鱼主养殖区每年夏季均暴发无乳链球菌病，死亡率高，造成严重的经济损失。如何防控我国的罗非鱼无乳链球菌病?不同宿主来源的无乳链球菌之间存在何种关系?能否将无乳链球菌视为一种人、哺乳动物和鱼类的共患病病原?均为研究的热点问题。对我国无乳链球菌鱼源株进行免疫原性蛋白的筛选和基因组学分析，具有重要的理论意义及应用前景。 1.无乳链球茸鱼源株的分离与毒力分析 在分离、鉴定病原菌的基础上进行特性分析。2010年夏季，从广东5个罗非鱼养殖场中分离到20株具有β溶血、革兰阳性的链状球菌。经PCR检测和16SrDNA测序比对，确定均为无乳链球菌，且血清型和MLST分型均为Ia，ST-7型。以斑马鱼作为实验动物，测定细菌毒力，分离株的LD50分布在102至104cfu之间，以分离株GD201008-001的毒力最强，LD50为2.3×102cfu，该菌株将作为后续研究的代表菌株。试验还发现鱼源分离株GD201008-001对ICR小鼠的致病力极强，1×101cfu攻毒剂量腹腔注射可引起小鼠脑炎并导致80％的接种动物在24小时内死亡，说明小鼠对该菌株极其敏感。提示无乳链球菌鱼源株存在感染人和哺乳动物的可能性。 2.无乳链球菌鱼源株免疫原性蛋白的筛选 免疫蛋白质组学能快速、准确、高效地鉴定免疫反应性蛋白抗原，是筛选亚单位疫苗候选的首选方法之一。采用免疫蛋白组学方法，以分离株GD201008-001兔高免血清、豚鼠康复血清和罗非鱼抗血清作为一抗，分别与转印在PVDF膜上的鱼源株GD201008-001全茵蛋白作用，筛选无乳链球菌在不同状态，不同宿主环境下的免疫反应性抗原。共鉴定18个蛋白，其中已报道的无乳链球菌免疫保护性蛋白有:磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，菌毛骨架蛋白(BP-2b)，磷酸甘油酸激酶(phosphoglyceratekinase)。此外，发现了7个新的免疫反应性的蛋白。选择免疫反应性强的8个候选蛋白进行原核表达及免疫转印，发现其中的3个蛋白:支链a酮酸脱氢酶E2亚单位（branched-chainalpha-ketoaciddehydrogenasesubunitE2），5核苷酸酶家族蛋白（5-nucleotidasefamilyprotein）以及氨甲酰基转移酶（ornithinecarbamoyltransferase）均可被兔高免血清、豚鼠康复血清和罗非鱼抗血清识别，表明这些蛋白在无乳链球菌鱼源株感染哺乳动物和鱼类的过程中，均与机体的免疫系统发生反应，刺激机体产生相应抗体，可作为候选的免疫保护性抗原。这一发现为后续无乳链球菌鱼源株亚单位疫苗的研发提供了基础。 3.链球菌表面蛋白筛选新方法的建立及在无乳链球菌中的应用 细菌的表面蛋白直接与宿主的免疫系统接触，往往是致病机理中重要的抗原或毒力因子，也是亚单位疫苗的候选物。借鉴免疫学中经典的交叉吸附方法，用高免血清与对应细菌进行混合吸附，获得吸附血清。将吸附血清和未吸附的高免血清分别用于免疫蛋白组学试验，比较两者免疫转印结果的差异，建立了一种筛选细菌表面蛋白的新方法:预吸附免疫蛋白组学方法(pre-absorbedimmunoproteomicsmethod，PAIM)。用此方法筛选到无乳链球菌鱼源株GD201008-001的一个表面蛋白，命名为XF。将该蛋白进行原核表达和免疫转印，发现其免疫反应性强，可被豚鼠康复血清和罗非鱼抗血清识别。说明预吸附免疫蛋白组学方法是一种行之有效的筛选细菌表面蛋白的方法，经其筛选到的表面蛋白XF是一种潜在的免疫保护性抗原，可作为亚单位疫苗的候选分子。 4.无乳链球菌鱼源株GD201008-001的xf基因缺失株构建及特性分析 为进一步研究PAIM试验筛选到的无乳链球菌鱼源株GD201008-001表面蛋白XF的功能，利用链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4S和pSET2，通过同源重组的方法构建了xf基因的缺失株△XF与互补株C△XF。生物特性分析表明，xf基因的缺失株与互补株的遗传稳定性较好，在细菌染色形态上与野生株无差异，生长速度略慢于野生株。三者对HEp-2细胞的粘附均不明显，且缺失株与野生株相比无明显差异。但是缺失株△XF对斑马鱼的毒力有明显下降，LD50上升4倍。说明XF蛋白参与了鱼源株GD201008-001对斑马鱼的致病过程，是一种与毒力相关的蛋白。 5.无乳链球茵鱼源株GD201008-001全基因组测序及比较基因组学分析 借助成熟的Roche454和IlluminaSolexa测序技术，通过序列拼接和补洞，完成了鱼源分离株GD201008-001的全基因组测序，在NCBI的基因组登录号为NC_018646。GD201008-001基因组大小2.1Mb，编码1964个蛋白，拥有7个rRNA和77个tRNA，它的基本特征和CRISPR、前噬菌体、毒力基因的分布，与另一株中国鱼源株ZQ0910以及人源株A909基因组最为相似。对不同宿主来源的15株无乳链球菌的基因组进行比较基因组学分析发现:在15株无乳链球菌中均保守存在的基因，即核心基因为1202个，有2040个基因是各菌株特有的基因，拟合曲线显示无乳链球菌泛基因组为开放型，说明在该细菌种内即便有数以千计的基因组被测序，还是会有新的基因出现。系统发生树显示，中国鱼源分离株GD201008-001、ZQ0910基因组与人源株A909属于同一分支，进化关系最近，提示可能来源同一祖先。研究还发现，有一段10kb的特有基因序列只存在于中国鱼源株GD201008-001和ZQ0910的基因组中，含有12个ORF。这段特有序列与咽峡炎链球菌（S.anginosus）SK52=DSM20563菌株的基因组序列最为相似。其中一个ORF(A964_1958)注释为LPXTG膜锚定蛋白。将A964_1958进行原核表达和免疫转印，发现它可与GD201008-001兔高免血清反应，表明A964_1958是一种新发现的免疫反应性蛋白，仅存在于中国无乳链球菌鱼源株中。同时将这段10kb的中国鱼源株特有基因序列从GD201008-001基因组中敲除，发现缺失株对斑马鱼的毒力明显增强，说明这段特有基因序列调控着某些毒力基因的表达，具体功能有待进一步的研究证实。