论文部分内容阅读
产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种革兰氏阳性、兼性胞内寄生的食源性致病菌，可引起人和动物的李斯特菌病。Lm的致病性与其能够侵染多种吞噬性细胞和非吞噬细胞，并在其中增殖有关。Lm致病性相关的多种毒力因子已被阐明，其中LLO和ActA蛋白是Lm必不可少的毒力因子。本研究构建了原核表达LLO和ActA蛋白的重组大肠杆菌，获得具有生物学活性的融合蛋白，并制备其特异性单克隆抗体。为研究Lm的致病机理、免疫机制和建立快速检测技术提供了重要条件。
一、产单核细胞李斯特菌hly和actA基因的原核表达及其产物特性LLO和ActA蛋白对Lm的胞内生产性感染非常重要，它们分别由hly和actA基因编码。LLO是分泌型蛋白，功能是溶解吞噬体膜，使Lm能够进入胞浆增殖；ActA是Lm的膜蛋白，能够聚集宿主细胞中的肌动蛋白，推动细菌在细胞内和细胞间的运动。本研究采用PCR技术分别从血清型4b和1/2a的Lm中扩增hly和actA基因，分别插入原核表达载体，构建出重组菌BL21(pGEX-6p-1-hly)、BL21(DE3)(pET-actA)和BL21(pGEX-6p-1-actA)，经IPTG诱导表达，利用亲和层析获得表达产物。SDS-PAGE结果表明表达的融合蛋白GST-LLO、His-ActA、GST-ActA与预期大小一致。试验表明融合蛋白具有生物学活性。
二、LLO单克隆抗体的制备与鉴定诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX-6p-1-hly)，对全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳，切割表达GST-LLO的目的条带，研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠，100μg/只，腹腔注射，间隔为两周，共免疫3次。融合前3天以纯化蛋白GST-LLO尾静脉加强免疫，7μg/只。按常规程序融合，纯化蛋白GST-LLO、GST作为检测抗原；间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得3株稳定分泌LLOMcAb的细胞株，命名为3B6、4D1、5D10，腹水效价分别为2×105、2×105、1×105。McAb的抗体亚类测定均为IgG1。溶血抑制试验表明3株单抗均能抑制LLO介导的溶解小鼠红细胞的能力。Dot-ELISA试验表明：3株单抗只与表达GST-LLO的重组大肠杆菌以及Lm分离株反应，与其它菌株不反应。Western-blot试验中，3株单抗均能与融合蛋白GST-LLO发生反应，出现特异性条带，而与纯化蛋白GST不反应。LLO特异性单克隆抗体的成功研制，为研究LLO以及巯醇激活的细胞溶素家族其他成员的生物学特性、控制Lm的致病性，以及建立快速检测Lm的方法奠定了基础。
三、ActA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定应用淋巴细胞杂交瘤技术，以重组菌BL21(DE3)(pET-actA)表达产物His-ActA蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠，腹腔注射，100μg/只。首免时，抗原与等量弗氏完全佐剂混合乳化；二免、三免时抗原与等量不完全弗氏佐剂混合乳化，间隔为两周；尾静脉加强免疫不加佐剂的抗原，100μg/只，3d后，取免疫鼠脾细胞和骨髓瘤Sp2/0-Ag-14细胞进行融合。纯化的GST-ActA作为检测抗原，用间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得4株稳定分泌ActAMcAb的细胞株，命名为1A5、2A2、3G11、6F5，腹水的效价依次为1×105、5×104、1×105、5×104。除2A2McAb亚类为IgM外，其余均为IgG1。Dot-ELISA试验表明，4株单抗只与表达His-ActA及GST-ActA的重组大肠杆菌反应，与其它菌株不反应。Western-blot试验显示4株单抗均能与融合蛋白His-ActA及GST-ActA发生反应，出现特异性条带。McAb1A5、2A2、3G11、6F5是针对ActA的特异性单克隆抗体，它们在研究ActA的生物学功能、Lm的致病性以及揭示细菌肌动蛋白运动机制等方面具有重要的应用价值。