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脓毒症（sepsis）被定义为感染及其导致的全身炎症反应综合征(SIRS)，炎症反应的过度激活及免疫失衡是脓毒症的本质特征，因此，在脓毒症早期控制促炎因子的过度释放、恢复免疫平衡，从而达到保护器官功能，改善预后的目的，这已成为脓毒症研究的核心问题。 普通肝素(unfractioned heparin，UFH)抗凝效果确切，在临床上广泛应用于防治血栓栓塞性疾病、DIC的早期治疗。除此之外，肝素还具有广泛的抗炎作用，可明显降低炎症介质表达，降低凝血活化，保护内皮细胞完整性，从而可能降低脓毒症病人的多器官功能障碍的发生及病死率。而针对脓毒症病人的3个有关抗凝剂的大样本Ⅲ期临床试验的安慰剂组病例分析同样表明，肝素组较未应用肝素组似乎有更高的生存率。虽然近年来，临床应用肝素治疗脓毒症的随机对照实验开始出现，但针对其有效性及安全性的评估结果并不一致。 目前，肝素并未作为抗炎药物应用于临床，除了对其出血的不良反应的担忧，对其复杂抗炎机制的认识不足也是一个重要原因。肝素抗炎作用的机制和确切作用位点尚不完全清楚。作为带负电荷的大分子物质，肝素通过胞吞作用进入细胞内十分缓慢，低浓度时甚至尚未形成完成的囊泡便已被降解代谢。有证据表明，低至1μg/ml的肝素可在2分钟以内通过调控细胞表面的Erk及钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)活化产生作用，而与细胞内蛋白激酶R的直接结合作用需要100μg/ml的肝素72小时以后才能发挥作用。因此，低剂量肝素的效果至少部分应作用于细胞外。 胞膜窖是细胞膜上富含胆固醇和鞘磷脂的壶腹状凹陷，参与了广泛的细胞作用过程。窖蛋白是胞膜窖的外壳蛋白，属于嵌膜蛋白质(integral membrane protein)家族成员，在不同的细胞中有些特定的功能，而窖蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)可能是体内炎症细胞潜在的重要免疫调节分予，并且在炎症信号传导过程中处于轴心位置，这其中包括巨噬细胞。有文献报道，不同免疫细胞所表达的Cav-1在感染或炎症反应中发挥了极其重要的调节作用。 有趣的是，有文章报道，肝素能够调控Cav-1的表达和亚细胞定位，然而在炎症过程中，他们之间是否存在相关性尚未被证实。揭示Cav-1参与炎症反应中的调控机制能够进一步理解Cav-1的功能，以帮助我们寻找治疗与炎症相关疾病新的靶点。 材料和方法: 一、研究对象 论文一针对肝素治疗脓毒症病人的有效性及安全性进行系统综述，通过计算机检索MEDLINE数据库、Cochrane图书馆、科学引文索引扩展板数据库(SCIE)、中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识基础设施工程数据库(CNKI)、维普数据库、万方数据库，检索时限均从2000年1月至2012年6月，纳入肝素治疗脓毒症的随机对照临床试验17个，共1167例脓毒症病人。 论文二、论文三及中实验用小鼠腹腔巨噬细胞均分离自未注射刺激物的C57BL/6小鼠。 二、实验材料 DMEM培养基、PBS、FBS、LPS、普通肝素、SB203580、NP-40裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液、TEMED、预染蛋白分子量标准、PVDF膜、ECL发光液、BSA、脱脂奶粉、羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、Mouse antiβ-actin-HRP、胎牛血清、脂质体2000、Super M-MLV反转录酶、RNAsimple Total RNA Kit、RNase固相清除剂、Powder琼脂糖、50×TAE、2×Power TaqPCR MasterMix、SYBR Green、小鼠TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β ELISA检测试剂盒。 三、实验方法 （一）筛选所有符合纳入标准的肝素治疗脓毒症的RCT研究，并采用Cochrane系统评价员手册5.1.0推荐的质量评价方法对其进行质量评价，对28天病死率、出血、凝血指标变化、住院时间、病情改善及器官保护进行数据提取，采用Revman5.1进行系统评价。 （二）ELISA检测炎症因子蛋白表达情况;Western blot检测caveolin-1蛋白及MAPK信号分子蛋白表达;siRNA转染下调caveolin-1表达;RT-PCR检测caveolin-1及炎症因子mRNA转录情况。 四、统计学分析 论文一统计学分析采用Revman5.1软件完成。结果数据以均值±标准差表示，所有原始数据使用单向方差分析进行(ANOVA)，然后通过Bonferroni检验进行多组两两比较。P＜0.05认为具有统计学意义。 结果: 一、肝素治疗脓毒症的有效性及安全性 1、与对照组相比，肝素能显著降低脓毒症患者28天病死率，其差异具有统计学意义[OR=0.59，95 CI(0.45，0.77)，P=0.0001]。 2、小剂量肝素治疗的病例中严重出血发生率很低。 3、肝素治疗未导致血小板计数明显下降，相反有助于纠正血小板降低[MD=13.94，95 CI(10.15，17.72)，P＜0.00001]，肝素对PT及APTT影响与对照组无统计学差异。 4、肝素对病人住院时间无明显影响，但可缩短住ICU时间[MD=-4.43，95 CI(-6.79,-2.07),P=0.0002]。 5、肝素治疗后脓毒症病人APACHEⅡ评分明显降低[MD=-2.58，95 CI(-3.29，-1.87)，P＜0.00001]，MODS发生率明显降低[OR=0.32，95 CI(0.17，0.61)，P=0.0006]。 二、肝素通过p38 MAPK通路抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子转录与表达 1、与对照组相比，100ng/ml LPS可诱导小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度分别增高2.74，4.30，4.04和4.54倍，mRNA转录分别增高2.28，2.52，1.99和2.84倍。 2、与单纯LPS刺激组比较，同时加用20μg/ml肝素能够使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度分别降低37.4，45.5％，42％和35.7％，mRNA转录水平也相应被抑制36％，35.7％，36.7％和44.4％，单纯加用肝素对TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度及mRNA转录均无明显影响。 3、与对照组相比，100ng/ml LPS刺激下，巨噬细胞p-ERK、p-JNK、p-p38浓度明显升高1.66，1.94和2.72倍，但ERK，JNK和p38 MAPK均无明显变化。与单纯LPS刺激组比较，同时加用20μg/ml肝素能够使p-p38上升1.56倍，却使p-JNK下降41.3％，而对p-ERK无明显影响。 4、与LPS+DMSO组相比，同时加用肝素能够使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度分别降低41.7％，52.2％，44.1％，41.9％;与LPS+DMSO+肝素组比较，LPS+肝素+SB203580组TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度明显增高(p＜0.05)，与LPS+DMSO组无统计学差异(p＞0.05)，SB203580明显减弱了肝素抑制炎症因子表达的作用。 三、caveolin-1是肝素抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子表达的关键分子 1、成功构建siRNA介导caveolin-1低表达巨噬细胞，与阴性对照及正常对照巨噬细胞相比，caveolin-1蛋白及mRNA表达分别下降75％和80％。 2、阴性对照及Cav-1低表达巨噬细胞在LPS诱导下，炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β浓度均明显升高，而且Cav-1低表达巨噬细胞炎症因子表达水平比阴性对照细胞更高，然而，后者能够被肝素明显抑制，而前者却不明显。单独给予肝素对转染的巨噬细胞炎症因子表达无明显影响。 3、在等量肝素作用下，p-p38 MAPK在正常及阴性对照巨噬细胞的表达无差异，而在Cav-1低表达巨噬细胞表达下降49％。 结论: 1、小剂量肝素可降低脓毒症病人的病死率，改善预后，且安全性较高。 2、LPS诱导上调小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β转录及蛋白表达，而肝素对其有明显抑制作用。 3、LPS可诱导小鼠腹腔巨噬细胞MAPK信号通路激活，肝素通过调控p38MAPK磷酸化发挥抗炎作用。 4、Cav-1是肝素通过p38 MAPK信号通路发挥抗炎作用的关键分子。