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青霉素是一种重要的β-内酰胺类广谱抗生素，其中间体六氨基青霉烷酸(6APA)可以作为其它半合成β内酰胺类抗生素如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等的合成原料。产黄青霉是青霉素的重要工业生产菌种。虽然在菌株改造、培养基优化以及过程模型化等方面已经有了大量研究，但是针对大规模反应器内由于补料引起的底物浓度梯度和由于机械搅拌引起的剪切梯度，很少有报道，了解还不清楚，导致很难进一步高效提高青霉素效价、产率和得率。为此，本文依托54吨大规模青霉素发酵罐内流体力学模拟数据，在实验室规模反应器内模拟大规模反应器内产黄青霉经历的流场环境，高效、经济地研究菌株的生理代谢响应。 首先，自主设计了快速取样设备，该设备可以满足在1秒以内进行胞内和胞外快速取样。制定了高产产黄青霉常规取样、胞内和胞外快速取样方法。在补料分批发酵模式下，将高产产黄青霉在含有唯一全位标记葡萄糖为碳源和一二位标记青霉素G合成前体苯乙酸的发酵体系进行培养，制备了全位标记13C胞内、胞外代谢物内标。建立了基于GC-MS和LC-MS/MS的胞内和胞外代谢物同位素稀释质谱分析方法。 其次，利用动态补料策略(Pulse，Ramp and Oscillation，PRO)快速研究了高产产黄青霉应对波动环境的响应机制，并获取不同补料策略下的胞内代谢物组学数据，再结合9-pool代谢结构化模型输出进行模型验证和代谢物数据分析，同时也为后续模型拓展和结构优化提供数据支撑。 再次，在实验室规模的5L反应器恒化培养体系内重现工业规模青霉素发酵罐内典型的功率输入，其中400RPM和600RPM分别代表工业青霉素发酵体系中远离桨区和桨区附近的功率输入（1.00和3.83kW/m3）。研究发现高产产黄青霉比菌体青霉素合成速率在低体积功率输入的情况下能够较好的维持，没有出现明显的菌株退化现象，而在高功率输入下其达到最高值后迅速降低。分别从代谢物浓度、代谢流、胞内外葡萄糖浓度以及转录水平研究了细胞应对不同功率输入的响应。与低功率输入相比，在高功率输入下，菌株退化伴随着20％的细胞裂解，22％的ATP缺口以及胞外葡萄糖浓度降低了20倍。与此同时，胞内的葡萄糖浓度却高了10倍，这意味着葡萄糖运输载体的亲和力增加。此外，计算的Batchelor扩散尺寸表明在菌丝葡萄糖运输部位存在葡萄糖扩散层。本研究中提出的葡萄糖扩散与吸收模型可以很好地验证该葡萄糖扩散层的存在。在高能量输入条件下，结合典型反应的质量作用比和ATP消耗数据，推断细胞可能感知胞外低的葡萄糖浓度并引发信号转导，进而触发了以糖异生为主的代谢流调整，磷酸戊糖途径的无效循环和胞内逐渐降低的胞质还原水平。在高能量输入条件下，高亲和力的葡萄糖运输载体的基因如Pc12g02880和Pc06g01340转录水平分别增加了3.5和3.3倍，异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的转录水平在恒化培养100h到200h内降低了2倍。总之，功率输入会对高产产黄青霉的退化以及葡萄糖运输产生影响，并且会导致代谢流量的重新调整，这些发现为进一步深入研究工业青霉素发酵过程奠定基础。 接着，在实验室规模恒化培养体系中通过a）在单个反应器内实行周期性补料b）在双组分反应器内，其中一个反应器进行连续补料，发酵液通过蠕动泵进行循环，来模拟工业规模底物浓度梯度。周期性补料用来模拟大规模反应器内菌体在数十秒至数分钟(30s，3min以及6min)时间尺度经历的底物浓度梯度;而双组分反应器主要模拟基于体积分配、6min平均停留时间的底物浓度梯度。在这些恒化培养体系中，本研究系统地（代谢流、代谢物以及mRNA）研究了高产产黄青霉在两种不同scale-down体系中应对底物浓度梯度的响应。在30s，3min以及6min周期性补料体系中，每个周期内，最高的底物浓度分别达到30μM，167μM和333μM。在3min和6min周期性补料经历一半时，菌体从底物过剩过渡到底物饥饿状态，大约50％的底物过剩和50％的底物饥饿，几乎没有底物限制状态，可以看作是54吨大规模青霉素发酵体系的简化模拟。而30s的周期性补料过程仅有底物限制状态。在平均停留时间为6min的双组分反应器内，补料罐内的底物浓度(57μM)是非补料罐内物底物浓度(19μM)的3倍。模拟的54吨大规模反应器内平均底物浓度为—Cs,avg≈34.4μM，刚好处于该双组分反应器底物浓度之间。双组分反应器没有出现底物饥饿状态。与单个反应器内连续补料模式相比，比菌体青霉素合成速率在30s，3min以及6min周期性补料体系中分别降低了10％，2倍和2.6倍。通过系统分析周期性补料条件下的动态代谢物组学数据，发现该高产产黄青霉可以将底物中过剩的碳储存于中心碳代谢的代谢物上，在菌体处于饥饿状态时重新进行利用。一个显著的区别是在平均停留时间为6min的双组分反应器内，比菌体青霉素合成速率受到影响较小。虽然胞外葡萄糖浓度水平差别很大（周期性补料为50％糖饥饿和50％糖过剩;双组分反应器内为100％糖限制），但是青霉素合成与3min周期性补料的结果类似。与周期性补料不一样的是:在双组分反应器内，代谢物组学数据表明除了胞内中间代谢物，胞内糖醇类物质（如甘露糖醇和阿拉伯糖醇）是非补料反应器内重要的碳供应载体。进一步的转录分析发现在周期性补料和双组分反应器体系中，青霉素合成基因簇和葡萄糖运输载体蛋白基因的表达水平明显不同。结果表明，比菌体青霉素合成能力与胞外葡萄糖浓度水平没有明显关系，但是与胞内葡萄糖浓度成负相关。 最后，通过分析定量代谢物组学数据，发现在高功率输入和底物浓度梯度等波动环境下，青霉素合成能力明显降低，而胞内海藻糖含量显著升高。为了进一步深入研究海藻糖途径与青霉素合成的实际内在关联，本研究利用土壤农杆菌介导的基因敲除方法，成功敲除了P.chrysogenum Wisconsin54-1255海藻糖途径基因tps1（编码海藻糖六磷酸合成酶）和tps2（编码海藻糖六磷酸磷酸酶）。系统研究了分别敲除海藻糖途径两个基因后，基因工程菌的生长、孢子形成和青霉素合成。结果表明海藻糖途径基因敲除对于青霉素合成和孢子形成不利，以及对于底物吸收和胞内代谢物浓度均有明显影响。