【摘 要】
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封闭带毒素(zonula occludens toxin,ZOT)是霍乱弧菌产毒菌株产生的一种内源性毒素.封闭带毒素可通过调节细胞间紧密连接(intracellular tight junction,Ti)改变上皮细胞的通
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封闭带毒素(zonula occludens toxin,ZOT)是霍乱弧菌产毒菌株产生的一种内源性毒素.封闭带毒素可通过调节细胞间紧密连接(intracellular tight junction,Ti)改变上皮细胞的通透性,促进蛋白、激素等大分子药物由粘膜吸收,增强可溶性蛋白的免疫原性,刺激粘膜免疫组织产生分泌型IgA,而且这一作用可逆、安全,不损伤组织,从而可能成为一种新颖、安全的粘膜免疫佐剂.zot基因位于霍乱弧菌溶原性的丝状噬菌体(CTXφ)基因组中.ZOT具有参与CTXφ的装配和调节上皮细胞间紧密连接的双重功能,这两种功能分别位于ZOT蛋白分子N末端部分和C末端区域,ZOT蛋白分子C-末端区域是ZOT蛋白调节细胞间紧密连接的活性中心.该研究采用PCR的方法扩增了zot基因编码264-399氨基酸残基的C末端△G片段,分别插入表达质粒pET-32a(+)和pRset-A,构建了表达融合蛋白Trx-His-△G的重组表达质粒pET-△G,和表达融合蛋白His-△G的重组表达质粒pRset-△G.将重组质粒转入表达菌BL-21(DE3)中,在终浓度1mmol/L IPrG诱导下进行表达,表达产物用SDS-PAGE检测.另将传染性囊病病毒(IBDV)的VP2基因克隆插入到pET32a(+)质粒,构建了pET-VP2重组质粒.重组质粒转入BL-21表达菌,在1mmol/LIPTG诱导下,重组蛋白pET-VP2以包涵体蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的19%.对VP2包涵体蛋白进行了粗提,最终获得了VP2蛋白含量约占47%的VP2包涵体蛋白.两种方法纯化的△G片段分别与VP2包涵体蛋白通过滴鼻免疫途径进行联合免疫实验,分别于免疫后10天、20天采集血清样品,进行ELISA实验,检测免疫抗体效价.动物免疫实验发现:融合蛋白Trx-His-△G起到了明显免疫增强效果,与VP2重组蛋白联合免疫二次后血清VP2 IgG抗体滴度是单独用VP2免疫组的两倍,并明显高于空白免疫组.His-△G-也表现一定免疫增强效果,血清IgG滴度高于VP2单独免疫组,但低于Trx-His-△G联合免疫组.该研究通过基因重组技术,将封闭带毒素C末端15KD片段在大肠杆菌中表达,并获得纯化蛋白.以纯化的△G蛋白作为粘膜免疫佐剂与IBDV重组蛋白VP2联合免疫,实验结果证实封闭带毒素C末端15KD片段可以通过滴鼻免疫方式发挥粘膜免疫佐剂效应.为ZOT的应用奠定了基础.
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