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第一部分 慢性乙型肝炎相关细胞免疫机制的研究
背景：乙型肝炎病毒(HBV)对被感染的肝细胞并没有直接的致细胞病变作用，HBV感染的慢性化一直以来被普遍认为主要是机体细胞免疫功能降低所致，但其细胞免疫功能低下机制尚未阐明。激活诱导细胞凋亡(AICD)可限制过强的免疫反应对机体造成的损害，但同时AICD所引起的外周血淋巴细胞免疫耐受可能是病毒得以在体内长期存在的重要原因；另外，辅助性T细胞(Th)对机体免疫系统有重要的调节作用。机体在正常的生理情况下，Th1、Th2两类细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，一旦平衡被打破，机体就会处于Th1优势或Th2优势的漂移状态，从而出现各种病理反应，包括病毒感染的慢性化。可见，外周血淋巴细胞发生AICD增加或者Th1/Th2功能失衡可能是导致HBV感染慢性化的重要原因。
研究目的：1.探讨AICD在HBV感染慢性化、重型化中的意义及AICD与血清病毒载量间的关系。
2.探讨Th1/Th2应答状态在慢性乙型肝炎发病机制中的意义。
研究方法：1.常规分离慢性/慢性重型乙型肝炎患者和健康体检者外周血单个核细胞(PBMC)，在植物血凝素(PHA)刺激下作短期培养后收集细胞，利用DNA电泳、倒置显微镜、Hoechst33258染色等对PBMC凋亡进行定性检测，采用AnnexinV/PI双染色法经流式细胞仪检测凋亡率，采用实时荧光定量PCR对血清HBVDNA含量进行检测。
2.ELISA法检测CHB患者和健康体检者PBMC体外经PHA刺激培养后上清液中Th1类细胞因子(IL-2，IFN-γ)和Th2类细胞因子(IL-4，IL-10)含量。
研究结果：1.倒置显微镜、荧光显微镜下凋亡淋巴细胞出现细胞皱缩、染色质浓缩、凝聚、边缘化、核致密等典型的凋亡细胞形态特征；DNA琼脂糖凝胶电泳呈特征性“梯状，，条带；静息淋巴细胞凋亡率在各组都比较低，两两比较差异无显著性(P＞0.05)。但与正常对照组比较，AICD在CHB患者轻中型组明显升高，而在重型组则降低，均有显著性差异(P＜0.05)；AICD在高病毒载量组最高，低病毒载量组最低，三组间两两比较差异有显著性(P＜0.05)。
2.CHB患者PBMC在PHA诱导下，培养上清液中的Th1类细胞因子(IL-2，IFN-γ)的水平明显低于正常对照组，两组比较均有极显著性差异(P＜0.01)；而Th2类细胞因子(IL-4，IL-10)水平明显升高，两组比较也均有极显著性差异(P＜0.01)。
结论：1.AICD与乙型肝炎慢性化及重型化有关且随病毒载量的增高而加重。2.CHB患者Th2优势应答，可能是HBV感染慢性化的机制之一。
本研究创新点：①通过结合分析HBV慢性感染时淋巴细胞发生AICD的现象和Th1/Th2功能状态，观察慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能变化，为细胞因子基因重组DNA疫苗的设计、免疫方案的选择提供重要信息，目前此类研究国内外正处于起步阶段。②凋亡细胞的定量检测方法，通常采用DNA结合染料PI染色法、检测DNA断裂点的TUNEL法等，具有错检率、漏检率高、特异性低的缺点。本研究利用的AnnexinV/PI双染法既可检测早期凋亡，又可区分凋亡与死亡细胞，较PI法、TUNEL法具有更高的灵敏性及特异性。且不需固定，省时省力，是目前流式细胞定量检测凋亡的首选方法。
第二部分: 黄芪抗HBV的作用及免疫调节活性
背景：乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一，我国是乙型肝炎的高流行区，全国估计有1.5亿HBV携带者，HBV感染易于慢性化、重症化，并与肝硬化、原发性肝癌的发生发展密切相关，对人们健康危害极大。目前常用的抗HBV药物，如干扰素(IFN)、核苷类似物等，价格比较昂贵，疗效也不够满意。因此，寻找安全有效的抗HBV药物成为医、药学领域十分迫切的热门课题。黄芪是祖国医学中最常用的补益药之一，有“扶正固本，补中益气”的功效，现代医学认为黄芪能增强机体免疫功能，调节免疫作用，增加抗体产生，促进IL-2、IL-3等细胞因子的分泌，明显提高机体的细胞免疫和体液免疫功能，并有良好的抗病毒作用。
研究目的：1.探讨黄芪对HBV抗原合成及DNA复制的抑制作用，并对其作用的分子机制进行初步探讨。
2.探讨黄芪对慢性乙型肝炎(CHB)患者Th1/Th2功能平衡的影响。
研究方法：1.选用能合成和分泌HBV颗粒和表达所有HBV抗原标志的HepG2.2.15细胞株为HBV感染模型，分别加入含不同浓度黄芪的DMEM培养液，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HepG2.2.15细胞培养上清中HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)含量的变化，计算药物对HBsAg、HBeAg的抑制率；采用水溶性四唑盐(WST-8)比色法测定药物细胞毒性作用，并计算细胞的存活率和治疗指数(TI)；通过荧光定量PCR法检测培养上清HBVDNA含量的变化，初步探讨药物作用的分子机制。同时以临床治疗乙肝常用药物更昔洛韦(GCV)为对照，综合评价黄芪的抗HBV效果。
2.CHB患者和健康人的PBMC体外经黄芪作用，培养48小时后，检测培养上清中Th1类细胞因子(IL-2，IFN-γ)和Th2类细胞因子(IL-4，IL-10)的含量变化。
研究结果：1.在黄芪的作用下，HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的量减少，并且与药物浓度和作用时间呈正相关。在同一浓度梯度下和时间段内，黄芪对HBsAg的抑制率均高于HBeAg。荧光定量PCR结果显示黄芪对HBVDNA无明显抑制作用。
2.黄芪对HBsAg、HBeAg的治疗指数均高于更昔洛韦。
3.在黄芪诱导下，健康对照组Th1类细胞因子(IL-2、IFN-γ)明显增高(P＜0.01)，Th2类细胞因子(IL-4、IL-10)水平无明显变化(P＞0.05)。
4.黄芪可明显提高CHB患者组Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)的分泌水平(P＜0.01)，尤以IFN-γ为著，而对Th2类细胞因子(IL-4、IL-10)水平无明显影响(P＞0.05)。
5.在黄芪诱导下，CHB患者组IFN-γ水平明显高于健康对照组(P＜0.01)，IL-2水平两组比较差异无显著性(P＞0.05)，Th2类细胞因子(IL-4、IL-10)水平CHB患者组比健康对照组高，有极显著性差异(P＜0.01)。
结论：1.黄芪具有较显著的抗HBV作用，其对HBV的抑制可能是作用于病毒的翻译、和蛋白合成等环节。
2.黄芪可明显提高CHB患者Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-2)的产生水平，改善CHB患者Th1/Th2功能失衡状态，可使CHB患者Th2优势应答状态部分得到纠正。
本研究创新点：①临床研究表明黄芪具有抗病毒及增强免疫功能的作用，但其对慢性乙型肝炎作用机制的系列实验研究，国内外尚未见报道。②慢性乙型肝炎的难治逾性，一直是困扰临床医生的一大难题，且我国慢性乙型肝炎患者愈百万，如何对CHB进行治疗一直是学者门研究的热点，本研究通过对黄芪抗HBV作用及免疫调节活性的探讨，为利用黄芪治疗慢性乙型肝炎提供新的药效学资料和理论基础，故本研究更具有实用性。