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视网膜色素变性的发病机制尚无定论。至今,仍不能确定感光细胞与色素上皮何者为原发病区。目前已鉴定出50多种基因和150多种突变与之相关,但这仅涵盖了60％的病例,其余40％由未知基因所引发。对于该病目前尚无疗效确切的治疗办法。
光感受器的丢失引起视网膜重塑表现为:视网膜色素上皮异位到视网膜神经上皮中；内核层细胞大量移入到神经节细胞层；神经节细胞异位；大量的神经节细胞、双极细胞和无长突细胞的丢失；水平细胞、双极细胞、无长突细胞和神经节细胞的突触在正常的丛状层之外形成了随机的神经束；Müller细胞肥大增生等。
视网膜色素变性根据其基因型不同有多种动物模型。其中Mer基因敲除小鼠和rd1小鼠是视网膜光感受器受损的良好模型,两种动物模型因不同的机制导致光感受器损伤,最终导致视网膜色素变性的发生。部分视网膜色素变性患者检出Mertk突变。
由此我们推测Mer基因敲除小鼠视网膜内层细胞是否也会发生与rd1鼠类似的改变?这些改变发生于哪个阶段?发生的过程如何?造成的结果如何?形态学的改变归因于神经元营养因子缺乏:如树突回缩是缺乏营养因子的最早表现之一,那么给予外源性神经元营养因子是否会对内层细胞有保护作用?
本实验的目的是观察MeR基因敲除小鼠视网膜内层细胞形态学的改变,研究这些形态学变化发生的时相关系,为将来进一步探讨外源性营养因子(BDNF、CNTF、bFGF等)对内层细胞的保护作用提供实验依据,希望能为视网膜色素变性治疗时机及治疗方法的选择提供科学依据。
第一部分:Mer基因敲除小鼠视网膜包含黑视素的神经节细胞形态学改变
目的:
观察Met基因敲除小鼠在出生后不同年龄阶段视网膜包含黑视素的神经节细胞的形态、数目、大小,对比其与正常小鼠的视网膜包含黑视素的神经节细胞之间的差异。
方法:
取生后4周、8周和三个月的Mer基因敲除小鼠和同年龄匹配的C57BL/6J小鼠的视网膜,利用免疫组织化学的方法显示包含黑视素的视网膜神经节细胞,观察200×视野下细胞形态的改变并计数200×视野下包含黑视素的视网膜神经节细胞的数目、胞体面积。
结果:
1、Mer基因敲除小鼠视网膜包含黑视素的神经节细胞的形态与正常对照组无明显差异。
2、Mer基因敲除小鼠视网膜包含黑视素的神经节细胞的数目在生后4周、8周在统计学上均与正常对照组差异无显著性(P值分别是0.090和0.539)；在生后三个月,Mer基因敲除小鼠视网膜包含黑视素的神经节细胞的数目在统计学上与正常对照组差异有显著性(P值0.014)。
3、Mer基因敲除小鼠视网膜包含黑视素的神经节细胞的胞体面积在生后4周在统计学上与正常对照组差异有显著性(P值0.028),在生后8周和三个月在统计学上与正常对照组差异无显著性(P值分别是0.268和0.255)。
结论:
Mer基因敲除小鼠视网膜包含黑视素的神经节细胞的形态在生后三个月内与正常对照组无显著差异(仅胞体面积在生后4周时较正常对照组明显增大),但细胞数目在生后三个月时较正常对照组明显减少。
第二部分:Mer基因敲除小鼠视网膜米勒(Müller)细胞形态学改变
目的:
观察Mer基因敲除小鼠在生后不同年龄阶段视网膜Müller细胞形态改变及Müller细胞中胶原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein GFAP)的表达情况与疾病病程的关系。对比其与正常小鼠视网膜Müller细胞之间的差异。
方法:
取生后15天、20天、4周、6周、8周、三个月、半年和一年Mer基因敲除小鼠和同年龄匹配的C57BL/6J小鼠的视网膜,利用免疫组织化学的方法显示视网膜Müller细胞及Müller细胞中GFAP,观察中央部和周边部视网膜Müller细胞形态改变及Müller细胞中GFAP的表达情况。
结果:
1、正常对照组的小鼠,视网膜中央和周边部Müller细胞中GFAP的表达仅局限于神经纤维层和神经节细胞层。
2、Mer基因敲除小鼠视网膜中央部Müller细胞中GFAP自生后4周开始表达增加,至生后8周GFAP表达贯穿视网膜全层；Mer基因敲除小鼠视网膜周边部Müller细胞中GFAP自生后20天开始表达,并在生后4周表达量贯穿全视网膜且持续至生后1年。
结论:
Mer基因敲除小鼠于生后20天视网膜周边部Müller细胞中GFAP表达即开始增高,并在生后4周表达量贯穿全视网膜且持续至生后1年,在视网膜中央部Müller细胞中GFAP自生后4周开始表达增加,至生后8周GFAP表达贯穿视网膜全层。
第三部分:Mer基因敲除小鼠视网膜双极细胞形态学改变
目的:
观察Mer基因敲除小鼠在生后不同年龄阶段视网膜双极细胞的形态、数目,对比其与正常小鼠的视网膜双极细胞之间的差异。
方法:
取生后4周、8周、三个月和一年的Mer基因敲除小鼠和同年龄匹配的C57BL/6J小鼠的视网膜,利用免疫组织化学的方法显示视网膜双极细胞,观察200×视野下细胞形态学改变并计数200×视野下双极细胞的数目。
结果:
1、Mer基因敲除小鼠视网膜双极细胞胞体的形态与正常对照组无明显差异。
2、Mer基因敲除小鼠视网膜双极细胞的树突和轴突末端不能正常发育,在P15d树突明显变短,P4w树突继续变短数量减少,至P8w树突几乎消失。生后一年,双极细胞的空间结构异常紊乱,树突萎缩,细胞排列杂乱无章的形态已经很明显,双极细胞向视网膜内层移位,表现出视网膜重塑现象。
3、Mer基因敲除小鼠视网膜双极细胞的数目在生后4周、8周及12周在统计学上均与正常对照组有显著性差异(P值分别是0.018、0.000和0.001.)
结论:
Mer基因敲除小鼠视网膜双极细胞胞体的形态与正常对照组无明显差异。Mer基因敲除小鼠视网膜双极细胞的数目在生后4周、8周及12周均较正常对照组显著减少,统计学上差异有显著性。双极细胞的树突和轴突末端不能正常发育,至P8w树突几乎消失。生后一年,双极细胞的空间结构异常紊乱,树突萎缩,细胞排列杂乱无章,双极细胞向视网膜内层移位,表现出视网膜重塑现象。
第四部分:Mer基因敲除小鼠视网膜水平细胞形态学改变
目的:
观察Mer基因敲除小鼠在生后不同年龄阶段视网膜水平细胞的形态、数目,对比其与正常小鼠的视网膜水平细胞之间的差异。
方法:
取生后4周、8周、三个月、一年的Mer基因敲除小鼠和同年龄匹配的C57BL/6J小鼠的视网膜,利用免疫组织化学的方法显示水平细胞,观察200×视野下细胞形态的改变并计数200×视野下水平细胞的数目。
结果:
1、Mer基因敲除小鼠视网膜水平细胞胞体的形态在生后不同年龄阶段与正常对照组无明显差异。
2、Mer基因敲除小鼠视网膜水平细胞在生后四周开始可见突起的芽状生长。生后三个月始视网膜水平细胞突起回缩。
3、Mer基因敲除小鼠视网膜水平细胞的数目在生后4周、8周在统计学上均与正常对照组差异无显著性(P值分别是0.869和0.075)；在生后三个月,Mer基因敲除小鼠视网膜水平细胞的数目在统计学上与正常对照组差异有显著性(P值0.005)。
结论:
Mer基因敲除小鼠视网膜水平细胞胞体的形态与正常对照组无明显差异。在生后四周始可见视网膜水平细胞突起的芽状生长。生后三个月始视网膜水平细胞突起回缩。且细胞数目在生后三个月时较正常对照组明显减少。第五部分:Mer基因敲除小鼠视网膜无长突细胞形态学改变
目的:
观察MeR基因敲除小鼠在生后不同年龄阶段视网膜无长突细胞的形态、数目、大小,对比其与正常小鼠的视网膜无长突细胞之间的差异。
方法:
取生后4周、8周和三个月的MeT基因敲除小鼠和同年龄匹配的C57BL/6J小鼠的视网膜,利用免疫组织化学的方法显示视网膜无长突细胞,观察200×视野下细胞形态的改变并计数200×视野下视网膜无长突细胞的数目、胞体面积。
结果:
1、Mer基因敲除小鼠视网膜无长突细胞的形态在不同年龄阶段与正常对照组无明显差异。
2、Mer基因敲除小鼠视网膜无长突细胞的数目在生后4周、8周、三个月在统计学上与正常对照组差异有显著性(P值分别是0.040,0.002,0.002)。
3、Mer基因敲除小鼠视网膜无长突细胞的胞体面积在生后4周和8周在统计学上与正常对照组差异无显著性(P值分别是0.378,0.193),在生后三个月在统计学上与正常对照组差异有显著性(P值是0.006)。
4、Mer基因敲除小鼠视网膜无长突细胞在视网膜切片上在内丛状层的两侧呈现典型的镜像对称分布。
结论:
Mer基因敲除小鼠视网膜无长突细胞的形态在生后三个月内与正常对照组无显著差异,细胞数目在生后随着年龄增加而逐渐减少,胞体面积在生后3个月明显增大。