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[背景与目的] 肺癌，以非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)为主，是世界范围内癌症致死的首要原因，其生存率在过去的二十年间并没有得到太大的改变，主要原因是大约2/3的病人在诊断时已经发生局部或远处转移。如果NSCLC在早期就得到发现，生存率将会大幅提高。肺癌传统的诊断主要依赖于影像学及痰脱落细胞学检查，作为早期发现或早期筛查的作用比较局限。因此，进一步深入研究NSCLC发生发展的分子机制，寻求有效的早期诊断标记，进行早期干预、早期治疗，是提高患者生存率的保证。 其中，抑癌基因(tumor suppressor genes，TSGs)5-CpG岛的DNA异常甲基化表现出良好的前景。DNA甲基化是最重要的一种表观遗传修饰方式，高甲基化所致基因转录失活，与胚胎发育和肿瘤疾病有着密切关系。由于DNA甲基化状态的改变常发生于遗传学改变之前，故早期检测到NSCLC患者特异性的CpG岛甲基化可作为肿瘤发生初期的依据之一。并且，肿瘤患者的外周血、痰液及支气管灌洗液等临床标本中，存在着循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)及肿瘤细胞坏死而间接释放出来的游离DNA，使得CpG岛甲基化成为一种无创的检查方法。 目前，DNA甲基化在NSCLC中的研究大多是针对西方人群的结果，并且在已有的报道中，这些最常发生甲基化的位点也往往不相一致，而国内的相关研究还比较有限。因此，本实验将在中国人群中确定一组敏感而特异的抑癌基因甲基化谱，探讨其在NSCLC发生发展中的意义和用于早期诊断的价值。我们联合检测20个相关抑癌基因在NSCLC组织中的甲基化状况，包括APC、BRCA1、CDH13、CMTM3、DAPK、DLEC1、EFEMP1、FHIT、hMLH1、KLK10、LSAMP、MGMT、NORE1A、OPCML、p14ARF、p16INK4A、RARβ、RASSF1A、RUNX3和 SFRP1，进而从中筛选出一组有效的基冈组合在血浆标本中进行验证。对部分特异性较好的抑癌基因SFRP1、DLEC1和KLK10，进一步进行mRNA或蛋白表达水平的分析，以明确DNA甲基化对这些基因的表达凋控在NSCLC发生发展中的作用。KLK10在肺癌中的功能研究尚未见诸报道，我们通过构建pEGFP-KLK10重组质粒载体，并稳定转染A549和SPC-A1肺腺癌细胞株，进行体内外实验，证实其在NSCLC中的抑癌基因功能。 [材料与方法] 1.标本收集:78例NSCLC患者组织标本（癌组织及癌旁＞5cm处或切缘处正常组织），110例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC患者（58例与组织匹配）及50例肺部良性病变组织或健康献血者的血浆标本。 2.基因组（组织和血浆）DNA提取，亚硫酸氢盐修饰，甲基化特异性PCR(MSP)检测各抑癌基因甲基化状况。 3.细胞培养及去甲基化药物处理:肺腺癌A549和SPC-A1细胞以10μmol/L的5-氮杂胞苷处理3d后进行DLEC1和KLK10基因甲基化和mRNA表达检测。 4.组织及细胞总RNA提取，RT-PCR或Realtime-PCR检测SFRPs、 DLEC1和KLK10基因mRNA表达。 5.免疫组织化学检测DLEC1基因蛋白表达。 6.构建KLK10基因重组质粒载体pEGFP-KLK10，并转染A549和SPC-A1细胞株，经双酶切、测序、RT-PCR和Westren鉴定。 7.平板克隆实验、裸鼠成瘤实验检测KLK10转染组细胞体内外增殖能力。 8.采用SPSS13.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。计量资料采用t检验，计数资料采用x2检验或Fisher确切概率法 [结果] 1.9个基因在NSCLC肿瘤组织和正常组织的甲基化具有显著差异（P≤0.001）:APC(44/78 vs10/78)、CDH13(38/78 vs8/78)、KLK10(36/78 vs5/78)、DLEC1(32/78 vs3/78)、RASSF1A(31/78 vs6/78)、EFEMP1(28/78 vs7/78)、SFRP1(25/78 vs6/78)、RARβ(24/78 vs7/78)、p16INK4A(20/78 vs5/78)，被筛选出来在110例Ⅰ/Ⅱ期NSCLC和50例非肿瘤血浆中进一步鉴定。9个基因在NSCLC血浆中的甲基化均高于非肿瘤血浆，且在血浆中的甲基化状况与组织中具有良好的一致性。APC、RASSF1A、CDH13、KLK10和DLEC1这5个甲基化位点的组合检测，对NSCLC诊断的敏感性达到83.64％，特异性为74.0％。 2.NORE1A、FHIT、CMTM3、LSAMP和OPCML5个基因仅在40例样本中检测，其余15个基因在78例样本中的甲基化分布情况表明，肿瘤组织的平均甲基化基因数显著高于正常组织(4.32±0.85 vs0.91±0.42，P＜0.001); CpG岛甲基化表型(CpG island methylatorphenotype，CIMP)刚性见于65.38％(51/78)的NSCLC组织而仅见于1.28％(1/78)的正常组织(P＜0.001)，并且CIMP阳性与患者临床分期(P=0.007)和淋巴结转移(P=0.031)相关。 3.SFRPs家族成员（SFRP1、2、4和5）中，SFRP1在41例(52.6％) NSCLC组织中的表达较正常组织下调或缺失(P=0.006)，SFRP2在肿瘤组织和正常组织中表达无显著差异（P＞.05），而SFRP4在71.8％(56/78)的NSCLC标本中表达上调(P＜0.001)，SFRP5在大部分(60.3％，47/78)的肿瘤组织和正常组织中均表达沉默。进一步分析SFRP1基因甲基化状况，发现32.1％(25/78)的NSCLC组织检出SFRP1启动子高甲基化，且与SFRP1转录本失活(P＜0.001)和患者淋巴结转移(P=0.039)有关。 4.41.0％(32/78)的NSCLC组织检出DLEC1启动子高甲基化，显著高于相应正常组织(3.8％，3/78)和良性对照组织(0/25)(P＜0.001)，且与患者临床分期(P=0.011)和淋巴结转移(P=0.019)有关。DLEC1 mRNA和蛋白表达在44例(56.4％)肿瘤组织中较正常组织和良性对照组织下调或缺失(P=0.012)，且与启动子高甲基化有关(P＜0.001)。5-氮杂胞苷处理使A549和SPC-A1细胞恢复DLEC1表达。 5.KLK10外显子3高甲基化在46.2％(36/78)的NSCLC组织中存在，显著高于相应正常组织(6.4％,5/78)和良性对照组织(0/25)(P＜0.001)，并与患者临床分期(P=0.013)和淋巴结转移(P=0.015)有关。45例(57.7％)肿瘤组织的KLK10 mRNA表达比相应正常组织和良性对照组织下调(P=0.010)，且KLK10转录本失活与外显子3高甲基化有关(P＜0.001)，5-氮杂胞苷处理亦使A549和SPC-A1细胞恢复KLK10表达。KLK10重组质粒转染的A549和SPC-A1细胞的体外克隆形成能力和裸鼠体内成瘤能力受到显著抑制。 [结论] 1.在中国人群中筛选出一组NSCLC敏感而特异的抑癌基因甲基化谱，有望应用于NSCLC辅助诊断。 2.CIMP阳性是NSCLC组织相对于正常组织的重要特征，为揭示其发病机制提供新的线索并可能作为NSCLC分类和预后评估的潜在指标。 3.高甲基化引起的SFRP1、DLEC1和KLK10基因失活是NSCLC发生发展中的重要分子事件。 4.首次证实KLK10基因在NSCLC中的抑癌基因功能。