论文部分内容阅读
α-亚麻酸(ALA)属于ω-3系列脂肪酸，是人体必需脂肪酸，也是称为“脑黄金”的超长链多不饱和脂肪酸EPA、DPA和DHA的前体。亚油酸、γ-亚麻酸属于ω-6系列脂肪酸。由于人们饮食结构的变化，ALA摄入量严重不足，ω-3系列与ω-6系列脂肪酸比例失调，导致了心脑血管疾病、免疫力下降、老年性痴呆、糖尿病、肥胖等的频发。人体自身不能合成ALA，只能从外界食物中获取。ALA的现行来源十分有限，远远达不到联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐的量。稻米是人类最重要的口粮之一，但其ALA含量少于万分之四，亚油酸与ALA的比例更是高达24∶1，因此迫切需要提高水稻种子中ALA的含量，降低亚油酸与ALA的比例。ω-3脂肪酸脱氢酶（ω-3FAD）催化业油酸生成ALA，它直接决定着植物中ALA的含量。利用基因工程技术导入外源或者提高内源ω-3FAD的表达水平，是提高植物中ALA含量，改良水稻脂肪酸品质的有效途径。
本研究分别从水稻和大豆中各克隆了三个ω-3FAD基因，通过水稻原生质体瞬时转化的方法鉴定了其在细胞中的分布特性。利用水稻胚特异性表达启动子（REG-2）、胚乳特异性表达启动子(GluC)和玉米组成型表达启动子（Ubi-1)分别驱动这六个ω-3FAD基因，构建了18个植物表达载体。采用农杆菌介导法进行遗传转化，获得455个独立的转基因植株。Southem、Northern和Western杂交分析，证明ω-3FAD基因已经以不同的拷贝数整合到水稻基因组中并且能在转基因植株中高效表达。
利用气相色谱仪对转基因植株成熟种子的胚和胚乳中脂肪酸组成进行了分析。结果显示，组成型、胚特异和胚乳特异表达的转基因水稻种子中ALA的含量均显著提高。非转基因植株胚中ALA含量为0.24±0.01mgg-1，胚特异性表达OsFAD3的转基因植株胚中是6.09±0.11mgg-1，是对照的25.4倍;胚乳特异性表达OsFAD3的转基因植株胚乳中ALA含量由野生型对照的0.27±0.01mgg-1提高到9.50±0.20mgg-1，增幅达35.2倍;组成型启动子表达OsFAD3的转基因植株胚和胚乳中ALA含量为5.11±0.11mgg-1和6.02±0.27mgg-1，分别是对照的21.3倍和22.3倍。与之相对应的亚油酸的含量与对照相比显著降低，亚油酸与ALA的比值分别降低了81.6倍、96.9倍、53.1倍和70.6倍。对T1、T2和T3代转基因水稻种子的ALA含量分析，表明三种类型转基因水稻富含ALA的性状能够稳定遗传。不同来源的ω-3FADs效应不同，过量表达内源的OsFAD3效果好于外源大豆的GmFAD3。REG-2启动子和GluC启动子过量表达ω-3FADs，对提高胚和胚乳中ALA的效果明显好于Ubi-1启动子。
应用薄层层析的方法分离了转基因水稻胚乳和胚中的单脂，结果表明过量表达ω-3FADs显著提高了水稻种子每种单脂中的ALA含量，但没有影响各个单脂的含量。对脂酰甘油的脂肪酸酰化位置分析表明，转基因水稻种子中ALA更倾向位于sn-2位，预示富含ALA的转基因水稻可能被人体有效地吸收和利用。
为实现ALA高含量转基因水稻的产业化，构建无选择标记的OsFAD3表达载体，以目前主栽品种宁粳1号为受体进行遗传转化，获得了44个独立转基因植株。经Southern杂交检测，从其分离后代中筛选获得了11个不含选择标记基因而只含有目的基因的转基因植株，Northern和Westem杂交，选出目的基因表达量高的植株进行脂肪酸组成分析。获得了ALA最高增加了11.0倍，含量是6.61±0.12mgg-1的转基因植株。对富含ALA转基因植株的总油脂含量、氨基酸组成、微量元素含量、株高、千粒重、结实率等进行测定，证明OsFAD3的过量表达没有对水稻的生长发育及主要农艺性状产生影响。
本研究结果表明，通过过量表达ω-3FADs，增强其表达水平，能够提高转基因水稻种子中ALA含量。以胚乳中ALA含量9.50±0.20mgg-1计算，成人每天食用250g大米就能满足FAO和WHO推荐的2.2g摄取量。因此，ALA高含量转基因水稻对于增进人们健康、节省医疗费用、增加农产品的科技附加值等具有重大社会意义和经济效应，具有广泛的推广应用前景。