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研究目的肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的一个病理过程。许多肝脏慢性炎症疾病如慢性乙型和丙型病毒性肝炎、慢性酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和原发性硬化性胆管炎等均可引起肝纤维化。肝纤维化作为肝脏对损伤的一种修复反应，其中心环节是肝脏炎症反应激活肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)，活化的HSC增殖加快，分泌大量胶原在细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过多沉积。目前，研究发现肝纤维化为一动态发展的可逆性病变，活化的HSC的凋亡是肝纤维化发生逆转的重要原因。活化的HSC凋亡主要受到神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的调节：肝实质细胞的慢性损伤时，一方面释放并激活各种炎性介质和细胞因子，形成―炎性瀑布‖，通过旁分泌途径促进HSC的活化、增殖，TLR4/NF-κB轴在炎症促肝纤维化发生中起着核心作用；另一方面，肝细胞会释放NGF，与活化HSC细胞上的受体p75NTR结合，诱导活化HSC凋亡，抑制胶原纤维的“过度”沉积，调节肝纤维化的进展。慢性肝病-肝纤维化发生过程中，循环脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）增多，主要与其受体TLR2/TLR4结合，通过TLR4/NF-κB轴促进肝纤维化的发生。肝纤维化的发生是活化HSC增殖/凋亡失衡的结果。那么，LPS-TLR2/TLR4-NF-κB是否对活化HSC凋亡有何影响呢？这值得我们进一步研究。已有研究发现，p75NTR的表达受到TLR相关的MyD88依赖性信号通路的调节。因此，我们推测肝纤维化发生时，高表达LPS一方面抑制肝细胞NGF的分泌，另一方面通过TLR-MyD88-NF-κB轴抑制p75NTR表达及凋亡相关通路，抑制活化HSC的凋亡，促进肝纤维化的发生与进展。本研究拟通过建立大鼠肝纤维化模型，观察血浆脂多糖浓度；分析其与肝纤维化的关系；分离大鼠HSC，体外LPS激活HSC的TLR4表达，siRNA干扰MyD88信号分子，阻断NF-κB，观察HSC对NGF诱导凋亡的反应，探讨TLR4调控的先天免疫反应对NGF诱导的HSC凋亡过程的影响；同时分离大鼠肝细胞，研究LPS对肝细胞NGF分泌的影响，从而说明TLR激活的相关途径在HSC凋亡中的作用，这将为炎症对肝纤维化进展及纤维化的逆转的调控机制提供新的思路与方法。研究方法采用两种致大鼠肝纤维化模型，分别为二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)腹腔注射4周所致化学损伤型肝纤维化模型（10μg/kg，每周连续3天）及胆管结扎(bile duct ligation，BDL)所致胆汁淤积性肝纤维化模型（约4周），检测各组血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine transarninase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TB)、直接胆红素(conjugatedbilirubin，DB)、凝血酶时间（prothrombin time，PT）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GGT）；伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色、Masson染色及苦味酸酸性复红（van gieson，VG）染色评估各组肝纤维化病理进程，研究两种不同机制所致肝纤维化大鼠的血浆脂多糖的浓度的变化；采用原位酶消化-密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞，体外脂多糖(LPS)(10μg/ml)不同时间(30min、1h、6h、12h)作用HSC，神经生长因子(NGF)不同浓度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)作用HSC24小时，确定LPS最佳作用时间和NGF最佳作用浓度；用CCK-8检测细胞增殖，LPS作用HSC1小时后，NGF继续作用HSC24小时，用流式细胞术、TUNEL法检测细胞凋亡，Real time-PCR与Western-blot分别检测细胞凋亡相关基因及蛋白的表达；并用MyD88SiRNA和抑制剂BAY分别干扰MyD88途径及阻断NF-κB信号通路，检测细胞凋亡相关基因及凋亡相关蛋白的表达和神经生长因子及其受体表达。同时分离大鼠肝细胞，研究LPS对肝细胞NGF分泌的影响及肝细胞对活化HSC凋亡的影响。结果一、肝纤维化与血浆LPS的关系1、与正常大鼠比较，BDL组模型大鼠血清PT、AST、 TB、 DB及γ-GGT明显增高（P<0.05或P<0.01）；ALB明显降低（P<0.05）；ALT水平无明显变化。与正常大鼠比较，DMN组大鼠（4w），血清PT、AST、 TB、 DB及γ-GGT均明显增高（P<0.05或P<0.01）；ALB明显降低（P<0.05）；ALT水平无明显变化。2、与正常大鼠比较，BDL模型大鼠血浆LPS浓度明显增高（P<0.01）；不同时间DMN模型组大鼠（2w、3w、4w）LPS浓度明显增高（P<0.05或P<0.01），并且第4周的LPS浓度最高（P<0.01）。二、脂多糖对活化肝星状细胞凋亡的影响1.成功分离、鉴定、培养HSC，LPS（10μg/ml）作用活化HSC不同时间(30min、1h、6h、12h)，LPS作用1h能明显促进TLR4、MyD88mRNA及TRAF mRNA水平的表达(P<0.01)；不同浓度的NGF（50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml）作用HSC24小时，发现NGF（200ng/ml）作用24h明显促进HSC凋亡，明显促进fas、bax、p53及p75NTR的mRNA水平的表达(P<0.05)，明显抑制bcl-2mRNA水平的表达(P<0.05)。2. NGF（200ng/ml，24h）能明显抑制HSC增殖(P<0.01)，LPS（10μg/ml，1h）能明显促进HSC细胞增殖(P<0.05)。3.流式细胞仪和FITC-TUNEL检测发现LPS（10μg/ml，1h）能明显抑制由NGF（200ng/ml，24h）诱导的HSC的凋亡(P<0.05)；4. Real time PCR显示LPS（10μg/ml，1h）能明显抑制由NGF（200ng/ml，24h）诱导的bax、p53/p75NTR、NGF的mRNA水平的表达(P<0.05)，明显促进NGF抑制的bcl-2mRNA的表达(P<0.05)。5. Western blot显示LPS（10μg/ml，1h）能明显抑制由NGF（200ng/ml，24h）诱导的bax、p75NTR、NGF、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9和PARP蛋白水平的表达(P<0.05)，能明显促进NGF抑制的bcl-2蛋白水平的表达(P<0.05)；三、MyD88依赖的NF-κB途径在LPS抑制活化HSC凋亡中的作用1、抗TLR2、TLR4抗体作用HSC后，发现TLR4而不是TLR2抗体能明显拮抗LPS对NGF诱导的HSC的凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleavedcaspase9、PARP及Bax的表达的抑制和p75NTR表达的抑制(P<0.05)。2、 LPS、MyD88siRNA对HSC凋亡没有明显影响；MyD88siRNA减少LPS对NGF诱导HSC凋亡的抑制(P<0.05)；MyD88siRNA能减少LPS对NGF诱导的HSC凋亡相关蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、PARP及Bax的表达的抑制和p75NTR表达的抑制(P<0.05)；且MyD88siRNA能明显抑制LPS作用HSC后p-IκB、p50和胞核p65蛋白水平的增加(P<0.05)。3、用NF-κB通路抑制剂BAY作用HSC，LPS对NGF诱导的HSC凋亡现象的抑制作用和凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-caspase9、PARP、bax表达的抑制作用及p75NTR表达的抑制作用明显减弱(P<0.05或P<0.01)。四、LPS对肝细胞/星状细胞共培养中HSC凋亡的影响1、成功分离肝细胞，LPS作用肝细胞后，肝细胞NGF mRNA的表达和NGF蛋白的表达均较正常明显减少(P<0.05)；2、活化的HSC能诱导肝细胞分泌NGF，且肝细胞与活化HSC共培养能诱导HSC的凋亡(P<0.05)。LPS作用后的肝细胞和活化HSC共培养，发现活化HSC凋亡明显减少(P<0.05)。结论1、肝纤维化形成过程中，血浆LPS浓度与肝纤维化发展成正相关。2、 LPS能抑制NGF诱导的活化HSC凋亡，至少是通过LPS-TLR4-MyD88-NF-κB途径实现的。3、 LPS能抑制肝细胞分泌NGF，从而抑制活化HSC的凋亡。