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本研究拟从动物试验、细胞试验和人体试验,探讨BR调动EPCs修复动脉内皮细胞损伤的效果和作用机制。
1、大鼠左颈总动脉内皮细胞拉脱模型的建立。
方法:12只雄性清洁级SD大鼠,脾脏切除两周后,用随机数字法将12只SD大鼠随机等分为两组:手术组(n=6)和假手术组(n=6)。颈部正中切口暴露左侧颈总动脉及其分叉处,从分叉处向近心端游离颈总动脉约2 cm。从左颈外动脉向颈总动脉插入2F的Fogarty导管约1.5 cm,然后向导管内注入200μl空气,重复拉脱3次。最后结扎颈外动脉的游离端并缝合颈中部切口。假手术组只暴露左侧颈总动脉及其分叉处,从分叉处向近心端游离颈总动脉约2cm。手术14 d后取损伤动脉段和对侧的正常动脉。利用病理学、免疫组织化学和电镜技术等方法评价,拉脱模型建立的效果。
结论:利用2F的Fogarty球囊导管可以建立大鼠左颈总动脉内皮细胞拉脱模型。
2、大鼠内皮祖细胞的体外诱导培养和鉴定方法:
方法:从大鼠下腔静脉取外周血共30ml,利用Ficoll-paque离心法得到外周血单个核细胞。利用VEGF、bFGF和EGF在体外诱导培养。培养7天后,利用免疫荧光技术进行鉴定。
结论:利用VEGF、bFGF和EGF可以在体外将大鼠外周血单个核细胞诱导分化为EPC。
3、内皮祖细胞移植修复大鼠颈总动脉内皮损伤。
方法:体外诱导扩增大鼠EPCs并利用Brdu进行标记。16只雄性SD大鼠,随机等分为两组,对照组和EPCs移植组。建立大鼠左颈总动脉拉脱模型,随后从颈外动脉向颈总动脉的损伤动脉段注入PBS溶液500μL含5×106个体外诱导分化并用Brdu标记的EPCs,保持30 min后松开两侧的动脉夹以恢复血流;对照组只注入等量的PBS溶液500μL。最后结扎颈外动脉的游离端并缝合颈中部切口。14 d后取损伤动脉段和对侧的正常动脉。利用病理学、免疫组织化学和图象分析技术对修复效果进行评价。
结论:EPCs可以定植到动脉损伤段并抑制新生内膜的生长,说明EPCs具有修复动脉损伤的作用。
4.血管内皮生长因子(vascular endothelium growth faetor,VEGF)调动内皮祖细胞修复动脉损伤的实验研究。
方法:将32只雄性SD大鼠,随机等分为两组:VEGF组和对照组。每组中随机选8只用于大鼠左颈总动脉内皮细胞拉脱模型的建立,另外8只用于抽血分离外周血单个核细胞以进行细胞培养。用于抽血分离外周血单个核细胞进行细胞培养的大鼠共注射7天药物,方法为:VEGF组用5 μg/ml的VEGF溶液200 μl/d,腹腔注射;对照组用PBS 200μl/d,腹腔注射。利用流式细胞术和细胞培养技术评价外周血中EPC的数目。用于建立模型的大鼠注射10天药物,方法为:VEGF组用5 μg/ml的VEGF溶液200 μl/d,腹腔注射;对照组用PBS 200 μl/d,腹腔注射。用于建立动物模型的大鼠,在药物注射7天时,利用Fogarty球囊导管建立大鼠左颈总动脉内皮细胞拉脱模型。并在手术后立即断尾取血100μl,利用流式细胞术评价外周血中Flk-1+的细胞比例。球囊损伤14天后,取损伤动脉段和对侧正常动脉利用病理学、免疫组织化学、电镜技术和图象分析技术进行评价。
结论: VEGF具有调动EPCs修复动脉损伤的作用。
5.黄连素动员大鼠骨髓EPCs对大鼠胸主动脉内皮细胞依赖的舒张功能的影响。
方法:12只雄性SD大鼠采用随机数字法等分为两组:对照组(n=6)和黄连素(Berberine,BR)组(n=6)。对照组每天给予饲养用水2ml灌胃;BR组每天给予15mg/ml的BR溶液45mg/Kg灌胃。药物共干预6天,第7天用颈椎脱臼法处死大鼠,然后迅速取出胸主动脉约1cm,并从下腔静脉取肝素抗凝血约5ml。利用流式细胞术和细胞培养技术测定BR干预7天后外周血中EPCs的数目。利用动脉环试验评价大鼠胸主动脉内皮细胞依赖的动脉舒张功能。
结论:BR可以调动大鼠骨髓EPCs,BR调动骨髓EPCs可能是BR改善内皮细胞功能的一种机制。
6.BR动员大鼠骨髓EPCs修复大鼠左颈总动脉内皮损伤的研究。
方法:18只雄性SD大鼠建立大鼠左颈总动脉内皮细胞拉脱模型后,采用随机数字法等分为三组:对照组(n=6)、BR组(n=6)和BR+L-NAME组(n=6)。动脉内皮细胞拉脱术前4天开始药物干预,共干预10天。
结论:BR可以调动大鼠骨髓EPCs,改善内皮细胞功能和加速损伤动脉的再内皮化。eNOS/NO系统参与了BR调动EPCs的过程。
7.BR调动人体EPCs对内皮细胞功能和动脉弹性的影响。
方法:20位健康志愿者服用BR 30天,0.4g tid。志愿者服药前和服药30天后进行生化指标的测定。受试者在动脉弹性功能测定后卧位休息15 min,然后检测受试者肱动脉对反应性充血的内皮依赖血管扩张反应(FMD)。服药前后抽取外周血,利用流式细胞术和细胞培养技术测定服药前后外周血中EPCs数目的变化
结论:BR可以调动人体EPCs,这可能是BR改善内皮细胞功能的机制之一。
8.BR对体外培养的EPCs功能的影响。
方法:20位健康志愿者服用BR30天,0.4gtid。志愿者服药前和服药30天后进行生化指标的测定,抽血前禁食12小时。服药前后抽取外周血,测定EPC-CFU数目和EPCs功能。并利用ELISA测定服药前后外周血中VEGF浓度;利用Greiss方法测定服药前后外周血中NO的浓度。
结论:BR可以上调外周循环中EPCs的功能,这可能与BR增加血浆中NO的浓度有关。