【摘 要】
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目的: 1.利用phdEasy系统构建携有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors, VEGF）165的重组腺病毒载体。 2.建立并优化兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cel
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目的: 1.利用phdEasy系统构建携有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors, VEGF）165的重组腺病毒载体。 2.建立并优化兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）的分离培养方案;观察MSCs体外培养特点和生物学特性。 3.观察重组腺病毒介导的VEGF165(vAd-VEGF165)转染兔MSCs后,细胞内VEGF165表达情况及vAd-VEGF165对MsCs的生长影响。 4.改良兔心肌梗死模型的制作方法;进行梗死后心功能测定。 5.研究VEGF165基因修饰后的MSCs移植于梗死心肌后的成血管作用和心功能改善程度。 方法: 1.VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV中,构建成pAdtrack-CMV-VEGF165。pAdtrack-CMV-VEGF165线性化后,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E. coli BJ5183感受态细菌中,实现细胞内同源重组。线性化重组质粒转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒(vAd-VEGF165),扩增重组腺病毒载体,荧光显微镜观察下绿色荧光表达。 2.红细胞裂解、Percoll和Ficoll三种方法分离骨髓单个核细胞,贴壁法培养,2.5ml/L胰酶消化传代培养MSCs。检测MSCs的CD44和HLA-DR的表达,鉴定不同分离方案所得MsCs的相对纯度。倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态,绘制原代和传代MSCs的生长曲线。对MSCs进行4,6二氨基-2-苯茚二酮（4,6 diamidino-2-phenylindole, DAPI）染色。 3.已构建的vAd-VEGF165转染兔第二代MSCs,观察不同时段绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）表达情况。利用免疫组化法,观察细胞内VEGF165蛋白的表达情况。采用ELISA法检测培养液上清VEGF165,
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