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研究背景和目的胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。高级别星型细胞瘤在胶质瘤中最常见,术后6个月常常会复发。近年来,尽管采用放疗和化学治疗等综合治疗,还是有超过80%的病人存活时间小于2年。特别是多形性胶质母细胞瘤,尽管目前采用综合治疗及某些新的治疗策略,但其中位生存期往往不到1年,且治疗后正常脑组织多会导致继发性损害。因此,过去几十年来对恶性胶质瘤的治疗并无明显进展。胶质瘤是一种具有浸润生长特征的实体肿瘤,其生长依赖于充分的血液供应,即不断发生的血管生成。研究发现,在肿瘤原发灶或转移病灶生长的早期,如果没有血管供应,则瘤体只能维持在2-3mm3大小的水平,而一旦血管开始出现,肿瘤则呈浸润性或膨胀性生长。已有研究发现抑制或阻断肿瘤的血管生成能够抑制肿瘤的生长和转移,或使原有病灶缩小至微小病灶水平。因而抗血管治疗目前已成为最具潜力的肿瘤治疗策略。一直以来,研究者们都认为由血管内皮细胞形成的内皮血管是肿瘤的唯一供血系统。只要阻断了内皮血管的生成,肿瘤的生长就会受到完全抑制。然而近年来却发现,单一抑制内皮血管的生成虽然可以引起肿瘤暂时的缩小,但是随后可能引发肿瘤侵袭力的进一步增强,生长更为迅速。在1999年,Maniotis等人报道了侵袭性黑色素细胞瘤中存在一种不依赖于血管内皮细胞而形成的管道样结构。这种管道的管壁由基底膜及肿瘤细胞排列构成,虽然没有血管结构,但是具有血管的功能,可运输血浆和红细胞。这种现象有别于传统的血管生成,仅为肿瘤细胞模拟血管的功能,因此将其命名为“血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)"。最初,McDonald等人对这种现象提出了强烈质疑,Lee等也认为黑色素瘤中的VM网络管道是肿瘤组织内微出血后继发的反应性表现。但随着世界范围的研究者提供越来越多的证据,VM的存在逐渐为人们所认可,并为人们提供了更多关于肿瘤治疗的新思路。Zhang等认为在恶性肿瘤生长的不同阶段。肿瘤组织内存在不同的肿瘤血液供应模式间彼此过渡的现象。即在肿瘤快速生长的早期肿瘤组织血液供应主要来自血管生成拟态；随着肿瘤体积的不断增大,内皮细胞构成的血管替代VM成为肿瘤血液供应的主要方式。许多研究表明,存在VM的肿瘤病人预后相对较差,5年生存率接近0%。胶质瘤中存在血管生成拟态也为许多研究者所报道,且血管生成拟态的出现与胶质瘤级别相关,高级别的胶质瘤出现血管生成拟态的几率远高于低级别胶质瘤。目前抑制胶质瘤血供的主要方法仍限于传统的抗内皮血管生成治疗,如果能够同时抑制血管生成拟态,则有可能较彻底地阻断肿瘤组织的血供。因此,深入研究血管生成拟态的机制,并寻找可能适合药物作用的靶点,将更有利于遏制肿瘤生长。研究发现,转化生长因子-β(TGF-β)及其受体TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ在高级别胶质瘤中过表达,而在低级别胶质瘤中低表达,因此推测其与恶性肿瘤进展相关。TGF-p通过旁分泌作用于血管内皮细胞促进血管生成、引起免疫抑制、促进胶质瘤细胞迁移,以及诱导细胞外基质蛋白如胶原和血管内皮生长因子的表达,是一种多功能的细胞因子。TGF-p在正常组织中低表达而在肿瘤组织中高表达可以提供较好的治疗特异性。在对乳腺癌治疗的研究中有研究者发现,TGF-p的抑制剂isoxanthohumol可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231血管生成拟态的形成。由此提示我们,对胶质瘤中TGF-p信号通路的抑制或许可减少血管生成拟态的形成,可能是一个抗VM治疗的新靶点。目前,TGF-p信号通路在胶质瘤血管生成拟态中的作用尚无报道。基质金属蛋白酶(MMP)家族在肿瘤侵袭、转移以及血管生成中起着重要作用。在对黑色素瘤血管生成拟态的研究中已经证实,MMP是血管生成拟态形成中所不可或缺的,尤其是MMP-2和MT1-MMP。研究表明,TGF-p信号通路可以调节以上两种MMP的表达。这提示我们,TGF-p如果能影响胶质瘤血管生成拟态的形成,很可能是通过调节MMP的表达来达到的。第一章稳定转染TGF-β shRNA质粒的U251MG细胞株构建目的构建稳定转染TGF-β shRNA质粒的U251MG细胞株,为研究TGF-β在胶质瘤血管生成拟态的形成中的作用提供实验模型。方法通过化学合成及PCR获得TGF-β shRNA基因片段,克隆入pYrl.1真核表达质粒,构建TGF-β shRNA载体,酶切并测序鉴定；将TGF-β shRNA质粒用脂质体转染试剂Lipofectamin2000TM转染至U251MG细胞,并使用抗生素G418进行筛选,扩大克隆,构建稳定表达细胞株。结果经酶切及测序验证,成功获得本实验需要的TGF-β shRNA质粒；质粒转染入U251MG细胞后,经筛选获得稳定低表达TGF-p的U251MG细胞株。RT-PCR检测质粒抑制TGF-p表达的效果显示,组间有显著差异(F=778.513,P<0.001)。pYr1.1A组及pYr1.1B组的TGF-β表达量较Mock组高,差异有统计学意义(分别为P=0.011和P<0.001)。ELISA检测培养上清的TGF-β浓度显示,组间差异具有统计学意义(F=4170.561,P<0.001)。pYr1.1A组及pYrl.1B组较Mock组浓度低,差异有统计学意义(分别为P<0.001和P<0.001)。结论成功构建稳定低表达TGF-p的U251MG细胞株,为研究TGF-β在胶质瘤血管生成拟态的形成奠定基础。第二章TGF-p基因沉默对U251MG在三维培养模型中血管生成拟态形成及拟态相关基因表达的影响目的研究TGF-p基因沉默对U251MG在三维培养模型中血管生成拟态的形成及拟态相关基因表达的影响。方法用三维培养及管道计数实验研究经不同处理后的U251MG细胞体外血管生成拟态能力的差别；用RT-PCR研究拟态形成的相关基因EphA2,VE-cadherin, MMP-2, MMP-9, MT1-MMP, LAMC2等的表达差异；用酶谱分析研究各组U251MG细胞MMP-2及MMP-9的活性程度。结果各组U251MG管道计数实验结果显示,组间差异具有统计学意义(F=22.509,P<0.001)。pYr1.1A组和pYrl.1B组的管道长度较U251MG组均减少,差异具有统计学意义(分别为P=0.041和P<0.001)。RT-PCR结果显示,只有MT1-MMP(F=74.519, P<0.001)组间有显著差异。其中,pYr1.1A组和pYr1.1B组的MT1-MMP表达较U251MG组均下降,差异有统计学意义(分别为P=0.015和P<0.001)。而pYr1.1B+rhTGF-β组较U251MG组表达增高,差异有统计学意义(P=0.038)。各组细胞上清MMP检测显示,4MP-2-active及MMP-2-pro组间表达有显著差异(分别为F=79.015,P<0.001及F=30.524,P<0.001)。pYr1.1A组和pYr1.1B组的MMP-2-active表达较U251MG组均下降,差异有统计学意义(分别为P=0.015和P<0.001), pYr1.1B+rhTGF-β组较U251MG组表达增高,差异有统计学意义(P=0.029);pYr1.1A组和pYr1.1B组的MMP-2-pro表达较U251MG组均升高,差异有统计学意义(分别为P=0.028和P<0.001)。结论TGF-p是U251MG细胞形成血管生成拟态所必需的；MT1-MMP参与TGF-p诱导的U251MG细胞血管生成拟态形成。第三章TGF-p基因沉默对U251MG裸鼠移植瘤中血管生成拟态形成的影响目的研究TGF-p基因沉默对U251MG裸鼠移植瘤中血管生成拟态的形成的影响。方法建立U251MG裸鼠移植瘤模型；RT-PCR及免疫组化检测各组TGF-p的表达差异；记录各组移植瘤生长至1cm3大小时所需时间长短；CD34-PAS双重染色显示VM的形态；管道计数实验比较各组VM数量差别；免疫组织化学技术检测肿瘤组织中MT1-MMP的表达变化。结果成功建立U251MG裸鼠移植瘤模型；U251MG组、NC组和pYrl.1B组肿瘤生长至1cm3大小所需的平均天数组间具有统计学差异(F=91.467,P<0.001)。pYr1.1B组较U251MG组时间生长缓慢,差异有统计学意义(P<0.001)。肿瘤组织中TGF-βmRNA表达有组间差异(F=970.049,P<0.001)。其中,pYr1.1B组TGF-β mRNA表达较U251MG组下降,差异有统计学意义(P<0.001)。肿瘤组织中TGF-β及MT1-MMP的表达有组间差异(分别为F=157.290, P<0.001及F=73.063,P<0.001)。pYr1.1B组肿瘤组织中TGF-p的表达较U251MG组下降,差异有统计学意义(P<0.001)；pYr1.1B组肿瘤组织中MT1-MMP的表达较U251MG组下降,差异有统计学意义(P<0.001)。CD34-PAS双染及VM管道计数结果显示,U251MG组、NC组和pYrl.1B组每视野平均VM管道的数量组间差异有统计学意义(F=15.030,P<0.001)。pYr1.1B组VM管道的数量较U251MG组减少,差异有统计学意义(P<0.001)。结论下调TGF-p的表达可以使肿瘤组织中VM形成能力下降,对抑制肿瘤血供有积极意义。