论文部分内容阅读
癌症已经成为困扰人类的重大公共健康问题之一,目前依然缺乏理想的治疗手段。现阶段,化疗依然是治疗癌症的主要手段。由于很多化疗药物直接或间接的来源于天然产物,且结构新颖的天然产物也常被用来寻找新的抗肿瘤靶点,因此积极寻找结构新颖的天然产物是抗肿瘤工作中重要的一部分。然而,近些年来中重复发现的问题日益突出,导致发现有价值的天然产物越来越困难。这可能与研究人员将过多的研究精力集中在经典的天然产物产生菌类群上有关。生物信息学研究发现,除了放线菌、芽孢杆菌等传统天然产物产生菌,海洋滑动细菌也具有巨大的天然产物合成潜力。因此,本研究将天然产物挖掘的目标转向了研究较少的海洋滑动细菌。除了积极寻找具有新颖结构的天然产物,充分利用现有化合物也是一项重要的工作。Disorazoles是从纤维堆囊菌中发现的一类大环内酯类化合物,其细胞毒性比埃博霉素强100倍。但由于靶向性较差,毒副作用严重,极大地限制了其应用。而随着靶向技术的不断发展,特别是对肿瘤靶向细菌研究的深入,使得利用特定的载体将高毒性的化合物靶向递送至肿瘤内部成为可能。利用这一策略不仅可以有效发挥化合物对肿瘤细胞的杀伤作用,同时还能避免其对正常组织的损伤,是一个有潜力的研究方向。本研究以肿瘤问题为出发点,分别从天然产物挖掘及靶向递送两个方面进行探索。主要研究内容及结论如下:(1)海洋滑动细菌新物种的分离及其天然产物合成潜力评价。本研究通过诱捕法从海洋来源的样品中分离得到了 100余株细菌,通过16s rRNA基因序列比对发现其中有1 1株潜在的新物种,且绝大部分属于海洋滑动细菌。这些菌株的分离纯化为研究其次级代谢产物奠定了基础。之后对分离得到的新物种进行了多种培养条件的发酵,并对其发酵产物进行了生物活性评价及液相色谱质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)检测。对其中一株生物活性较好的海洋拟杆菌Fulviviga sp.W222进行了全基因组测序,发现其中包含多个新颖的次级代谢产物合成基因簇,说明其具有天然产物合成潜力。(2)新型铁载体fulvivirgamide的挖掘及其生物合成途径的确定。菌株W222中含有一个去铁胺类(Desferrioxamine,DFO)铁载体的生物合成基因簇(Biosynthesis Gene Cluster,BGC)。与已知基因簇相比,其中还包含两个未知功能的基因(fulE及fulF),且这两个基因在拟杆菌类群中相对比较保守的。说明它们具有比较重要的生物学功能,可能负责合成一类新的DFO类铁载体。结合Chrome azurol S(CAS)实验与铁离子添加实验,利用LC-MS对菌株W222的发酵产物进行检测,确定了其中可能的铁载体的吸收峰及分子量。进一步地高分辨质谱(High Resolution Mass Spectrometry,HRMS)检测确定了它们的精确分子量及可能的分子式,推测其可能是Desferrioxamine Gi(DFOGi)伯胺氮原子酰基化的产物,并将其命名为灰黄杆菌胺(fulvivirgamide,FVM)。为了确定FVM的结构,我们利用色谱分离的方法对其中产量较高的化合物(1-4)进行了分离纯化,并通过NMR结合HRMS及MS/MS确定了其化学机构。化合物1-4分别是DFOG1伯胺氮原子被苯乙酰基、乙酰基、丙酰基及异丁酰基修饰的产物。通过解析出的化学结构结合HRMS及MS/MS,推测出了另外一些铁载体的大致结构,均为DFOG1伯胺氮原子被不同脂肪酸或芳香族脂肪酸酰基化的产物。为了确定FVM的生物合成途径,我们将其基因簇中可能的功能基因克隆到了共表达质粒上,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)进行异源表达。通过比较不同转化子的发酵产物,证明了 FulF为一个全新的酰基转移酶,负责DFOG1伯胺氮原子的酰基化。为了明确FulF的底物,我们向BL21(DE3):;fwlF的发酵培养基中添加了DFOG1及肉豆蔻酸,并在其产物中发现了目标产物FVMB14,说明FulF可以催化DFOGi的酰基化过程。对分离到的化合物(1-3)进行了细胞毒性实验检测,发现其对三种人源肿瘤细胞都具有抑制所用,IC50介于9到19μM之间。(3)Disorazoles异源表达宿主的构建。异源表达不仅可以促进disorazoles的相关研究,同时也是靶向递送的前提。泰国伯克氏菌(Burkholderia thailandensis)E264是一株分离自泰国水稻田里的革兰氏阴性细菌,与其它肿瘤靶向细菌相比,菌株E264次级代谢产物丰富,可以为异源基因簇的表达提供丰富的前体物质,具有成为异源表达宿主的潜力。但由于其可用的筛选标记较少,因此在一定程度上限制了其应用。本研究利用两步单交换结合反向筛选的方法对B.thailandensis E264基因组上的3个多重耐药外排泵(MDR pumps)进行了无痕敲除,得到了一株对常用抗生素普遍敏感的突变株。除了耐药性的变化,敲除耐药泵的突变株生长速度没有明显的变化,保留了其生长速度快的优势。之后,我们将disorazole A1的生物合成基因簇通过E.coli WM3064介导的结合转移转至突变株E264ABAC中,并在其M8培养基的发酵产物中检测到三个特异的吸收峰。经NMR确证保留时间为16.8min的质谱峰峰是disorazole A1的衍生物disorazole F2。对比二者的结构发现这可能是由于B.thailandensis E264中缺乏相应的甲基转移酶和细胞色素P450导致的。通过突变株E264ABAC异源表达得到的产物排除了后修饰酶的影响,大大方便了其生物合成途径的解析。而在表达disorazole Z生物合成基因簇的过程中也出现了同样的情况,只检测到了其酯基缺失的衍生物。经生物合成分析推测,这也可能是由位于其生物合成基因簇外的细胞色素P450和羧酸酯酶催化的。(4)B.thailandensis E264肿瘤定植特性及disorazole的靶向递送。Disorazoles在B.thailandensis E264中的成功表达,为其肿瘤靶向递送提供了基础。但由于野生型E264毒性较大,因此我们首先依据沙门氏菌的减毒策略构建了两株减毒株E264ΔwaaN及E264ΔrelAΔspoT,并对野生型E264及其减毒株的毒性进行了评价,发现E264AwaaN的毒性有了明显的降低,同时低剂量的野生型E264的致死率也较低。之后的肿瘤定植实验结果显示,虽然E264ΔwaaN的毒性较低,但其肿瘤定植的能力也受到了一定程度的影响,而低剂量注射的野生型E264不仅安全性有保障,且其最终在肿瘤内部定植的密度也没有受到影响。结合毒性及肿瘤定植能力的实验结果,最终我们选择以低剂量的野生型E264作为递送载体,将disorazole直接递送至肿瘤内部,以达到更为理想的抗肿瘤效果。但最终的实验结果显示,相较于野生型菌株E264,转化子E264::disA的抗肿瘤效果并没有明显的提高。推测可能是由于肿瘤内部的生长环境较为严苛,E264在其中的生长受到抑制,并不能有效地表达外源基因簇导致的。本研究从非经典的天然产物产生菌——海洋滑动细菌中发现了一类新型的去铁胺类铁载体;构建了一个新的表达宿主E264ABAC,并利用其实现了disorazoles化合物的异源表达;最后,对B.thailandensis E264作为高毒性化合物靶向递送载体的可能性及局限性进行了初步探索。