洋葱伯克霍尔德氏菌ATCC17616复制起始区的序列分析及验证

• 作 者: 蔡宇航
• 机 构: 天津大学
• 出 处: 天津大学
• 发表日期: 2013年期
• 关键词: 洋葱伯克霍尔德氏菌 复制起始区 分子克隆 蛋白纯化 核酸 染色体

DNA复制是指在细胞分裂以前,DNA双链进行的复制过程,是生物遗传的基础,主要包括引发、延伸及终止三个阶段。其中,复制起始是细菌细胞生命周期中的一个中心事件,对于DNA复制起始区的识别也就成为研究DNA复制起始过程的一个重要基础阶段。目前对于细菌复制起始区的预测及确定工作并没有得到广泛的开展,尤其是对于多染色体菌种复制起始区的预测及验证工作尚处于基本空白的状态。但是随着全基因组测序技术的快速发展,相应的复制起始区预测及确定工作也应得到广泛发展。本课题利用天津大学生物信息中心所研发的细菌基因组复制起始区预测算法Ori-Finder软件对Burkholderia multivorans ATCC 17616菌种的复制起始区进行预测,利用分子克隆的方法得到预测核酸产物及已知的复制起始蛋白,通过蛋白与核酸相互作用实验,验证软件预测结果的准确性,为其能够广泛应用于细菌基因组复制起始区的预测工作,以及从海量基因组数据中高效提取有用的信息奠定了重要的理论和实验基础。　　首先,利用分子克隆的方法,根据软件预测信息,构建ATCC 17616菌种三条染色体复制起始区克隆载体pSURE-T-oriC,进一步扩增得到oriC的准确序列产物。然后,根据NCBI上提供的菌种信息,构建已知的ATCC 17616复制起始蛋白表达载体pET28a-dnaA,并对蛋白进行表达纯化。最后,利用EMSA方法对dnaA与oriC的相互作用关系进行验证。从已知的dnaA与预测得到的三条染色体oriC相互作用结果可以看出,同条染色体上的蛋白与核酸有相互作用关系,初步确定预测结果正确,但其余两条染色体上的oriC区域与已知的dnaA无明显相互作用,但并不说明软件预测结果错误,因为其可能对应结合相同染色体上的其他蛋白结构,需要进一步实验验证。