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精氨酸甲基化转移酶5是Ⅱ型蛋白质精氨酸甲基转移酶,在转录调控、mRNA剪切、信号转导、DNA修复等多种生命活动中发挥重要作用。而Prmt5在鱼类低氧适应中的作用研究尚未见报道。血红素加氧酶1(Ho1)是血红素降解的起始酶和限速酶,可降解血红素生成胆绿素、CO和游离铁,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。我们前面的研究发现,斑马鱼和鲫鱼的ho1基因是低氧应答基因,在低氧应激的过程中发挥保护作用,但其在低氧应答过程中的表达调控机制尚不完全清楚。在此基础上,本论文克隆了草鱼prmt5和ho1基因的开放阅读框序列,然后利用离体实验模型草鱼卵巢细胞(CO)初步研究了低氧条件下精氨酸甲基化转移酶5(prmt5)对Ho1表达的调控作用。取得的主要结果如下:利用PCR扩增得到草鱼prmt5基因的ORF序列。草鱼prmt5 ORF全长1896bp,编码631个氨基酸。对Prmt5进行氨基酸序列多重比对和系统进化分析,结果发现草鱼Prmt5同其他物种Prmt5蛋白之间的相似性在77%-97%之间,在进化上非常保守。对草鱼Prmt5的蛋白结构进行预测,发现Prmt5含有一个Prmts家族特有的甲基转移酶催化结构域(SAMBD)。qRT-PCR分析表明,prmt5在草鱼的心、肝、脾、肾、脑、鳃、精巢等组织中均有表达,但在肝中的表达量最高。低氧处理CO细胞,发现低氧处理6h后prmt5的mRNA水平显著升高,而随着处理时间的增加,prmt5的mRNA水平显著下调。利用PCR扩增得到草鱼ho1基因的ORF序列。草鱼ho1基因ORF全长816bp,编码271个氨基酸。对Ho1进行氨基酸序列多重比对和系统进化分析,结果表明草鱼Ho1同其他物种Ho1蛋白之间的相似性在46%-90%之间,在进化上非常保守。对草鱼Ho1的蛋白结构进行预测,发现Ho1含有一个血红素加氧酶结构域和一个C端跨膜区。qRT-PCR分析表明,ho1基因在草鱼的心、肝、脾、肾、脑、鳃、精巢等组织中均有表达,在肝中的表达量最高。低氧处理CO细胞,发现低氧处理6h和12h后ho1基因的mRNA水平显著升高,而随着处理时间的延长,ho1基因的mRNA回复到正常水平。构建Prmt5的过表达载体,转染CO细胞,使草鱼Prmt5表达量升高。同时,设计合成Prmt5的shRNA,转染CO细胞,使Prmt5的表达量降低。然后研究了 Prmt5过表达和敲降后CO细胞中Ho1的表达情况。qRT-PCR和Western B1ot的分析结果表明,在常氧条件下,过表达Prmt5后CO细胞中ho1基因的mRNA和蛋白水平均显著上升;敲降Prmt5后CO细胞ho1基因的mRNA和蛋白水平均显著降低。在低氧处理6h的实验组中,过表达Prmt5使CO细胞中ho1基因的mRNA水平显著上升,敲降Prmt5后CO细胞中ho1基因的蛋白水平显著降低。这些结果表明,在常氧和低氧的情况下草鱼Prmt5对Ho1的表达均具有一定的促进作用。本论文还研究了草鱼Prmt5对Hif1α mRNA水平和转录活性的影响,初步探讨了HIF信号通路在草鱼Prmt5调控Ho1表达中的作用。Real Time PCR的分析表明,在常氧条件下,过表达Prmt5后CO细胞中hif1α及其靶基因igfbp1和cited3的mRNA水平均显著上升。在低氧处理6h的实验组中,过表达Prmt5后CO细胞中hif1α基因的mRNA水平显著上升,靶基因igfbp1和cited3的mRNA水平也有所增加。双荧光素酶报告基因实验分析表明,过表达Prmt5后hif1α的转录活性显著上升。这些结果表明,超表达Prmt5上调了hif1α的mRNA水平,并对Hif1α的转录活性具有增强作用,预示HIF信号通路可能在草鱼Prmt5调控Ho1表达的过程中发挥作用,这还有待实验进一步证实。此外,我们构建了草鱼Hif1α原核表达载体,并对Hif1α融合蛋白进行了诱导。Western Blot的结果表明,Hif1α融合蛋白被成功诱导,存在于上清中,目前Hif1α融合蛋白正在纯化中。草鱼Hiflα原核表达载体的构建和融合蛋白的诱导将为草鱼Hif1α抗体的制备以及后续进一步研究HIF信号通路在草鱼Prmt5调控Ho1表达中的作用奠定基础。