【摘 要】
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该研究以杆仲5、6月份新长成的幼嫩树皮为材料,提取总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链式反应)合成cDNA双链,以Uni-ZAP XR vector为载体,构建了杜仲树皮的cDNA文库,此文库
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该研究以杆仲5、6月份新长成的幼嫩树皮为材料,提取总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链式反应)合成cDNA双链,以Uni-ZAP XR vector为载体,构建了杜仲树皮的cDNA文库,此文库的滴度为3.4×10<10>pfu/ml,含插入片段的频率是99﹪,插入片段的大小为400bp-2500bp.该研究还采用了RT-PCR方法,以杆仲树叶总RNA为模板扩增出杜仲法呢基焦磷酸合酶基因EuFPS,克隆至质粒pUCm-T中.序列分析表明,该克隆插入的片段全长为1212bp,开放阅读框共编码320个氨基酸,在GenBank中查询和分析,发现核酸序列与拟南芥菜,巴西橡胶树和苹果树的FPP合酶的序列同源性为81﹪、87﹪、82﹪.异戊烯基转移酶具有两个共同的氨基酸序列保守域[LIVM][LIVM]XDDXXDXXXRRG和[LIVMFY]GXXFQ[LIVM]XDD[LIVMFY]X[DN],它们也存在于杜仲FPS基因推测的肽链的第96氨基酸残基[LVLDDIMDSSHTRRG]和第230氨基酸残基[MGSYFQVQDDYLD]处,这两区域可能代表着这一类酶的活性中心.通过定向克隆的手段,构建表达载体pBI-FPS,内含有全长日的基因法呢基焦磷酸合酶基因EuFPS,采用冻融法转化农杆菌LBA4404,再用农杆菌介导法将目的基因EuFPS转入烟草,获得转基因烟草.
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