腭裂发生中TBX22外显子5甲基化与腭融合的相关性

• 作 者: 李珂
• 机 构: 汕头大学
• 出 处: 汕头大学
• 发表日期: 2019年1期
• 关键词: 腭裂

【目的】
　　DNA甲基化是胚胎发育中时空调控基因表达所必需的。本研究旨在探讨全反式维甲酸（ATRA）诱导的腭板融合与TBX22基因外显子5甲基化的关系及可能的机制。
　　【方法】
　　1.建立ATRA诱导的C57BL/6J系小鼠腭裂模型，在胚鼠妊娠10.5天（E10.5）时，实验组孕鼠按70毫克/千克ATRA溶液灌胃，对照组孕鼠用0.2ml/Kg玉米油灌胃。分别于E13.5、14.5、16.5处死实验组孕鼠，取得胚鼠腭板组织，新鲜腭板标本取下后，立即放无菌冻存管，随即置于液氮冻存30分钟，后转至-80摄氏度冰箱中保存，备后续实验。
　　2．用常规的十六烷基三甲基溴化铵方法从胚胎小鼠腭突间提取了E13.5、E14.5和E16.5基因组DNA，并用MethylRAD制备了基因组文库，然后使用高通量测序技术进行基因组测序，根据参考序列，使用SOAP程序(Version2.21)将单个酶读长映射到CmCGG位点的参考序列。整合甲基化特异性PCR及MethylRAD-seq数据，使用及qPCR验证TBX22表达水平，最后，再进行数据分析。实验组与对照组数据比较：（1）鉴定与腭裂相关的组织学；（2）确定与腭裂相关的TBX22外显子5的位置关系；（3）确定与腭裂相关的TBX22的表达与TBX22外显子5甲基化水平的关系；（4）确定TBX22第5外显子在CpG位点的甲基化模式。
　　【结果】
　　1.在对照胚胎的腭板组织切片中，在E13.5处腭板分离，在E14.5处与中线接触，在E16.5处完全融合，而在经ATRA处理的胚胎腭板组织切片中，在E13.5、E14.5和E16.5处腭板仍保持分离而未融合。
　　2.根据MethylRAD-seq数据，在E13.5和E14.5处，ATRA处理组，在CpG位置上TBX22外显子超甲基化，但是ATRA处理组和对照组在E16.5位点的甲基化水平无显著性差异。
　　3.MSP结果显示在E13.5和E14.5，ATRA处理组的电泳条带的亮度比对照组的电泳条带的亮度相对增加，而在E16.5处与对照组无显著差异。
　　4.ATRA处理的胚胎中，在E13.5和E14.5时，TBX22外显子5的mRNA表达与甲基化之间存在负相关关系，表明TBX22第5外显子内的CpG位点高度甲基化，可能使TBX22表达降低。
　　【结论】
　　TBX22外显子5的CpG位点甲基化导致TBX22外显子5的点突变，可能抑制TBX22的表达，甲基化的改变可能与CP的发生密切相关有关。