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目的
铁负荷状况是指铁在机体内储备水平和满足机体生理功能及代谢需要的程度，铁缺乏和铁过载都会对健康产生不良影响。随着慢性疾病的发生和发展，铁过载检出率呈现逐年上升趋势，但尚未引起重视，相关研究较少。随着人们饮酒量和红肉摄入量(或使用铁补充剂)的不断增加，给人们的健康带来不良影响。本研究旨在分析成年人体内铁营养状况与肝功能异常的关系，评估铁过载和饮酒对肝功能异常的风险；在此基础上，建立酒精暴露、铁过量及其联合暴露诱导的肝损伤大鼠动物模型，观察海兔素(Aplysin)补充改善大鼠肝损伤和肠道微生态的效果及其可能的作用机制。为指导人群合理摄入富铁食物(或补充铁剂)和适量饮酒，有效地预防和控制肝损伤提供科学依据。
方法
本研究采用人群横断面调查和动物实验的方法进行研究。
横断面调查研究对象及分组。人群研究采用横断面调查的方法，选取青岛市两家医院2014年1月至2015年10月参加健康体检的35-76岁6858名成年人群作为研究对象，收集个人基本信息、生活方式、体格检查、生化检测等信息资料。将血清铁蛋白(SF)水平按最低铁负荷组(Q1)，中低铁负荷组(Q2)、中高铁负荷组(Q3)和最高铁负荷组(Q4)四分位进行分析。采用回归分析不同铁蛋白水平与肝功能异常的关系。在此基础上，参照世界卫生组织(WHO)推荐判断机体的铁营养状况的血清铁蛋白水平(SF)标准：SF＜15μg/L为铁缺乏；男性SF15-200μg/L和女性SF15-150μg/L为铁营养状况良好；男性SF＞200μg/L和女性SF>150μg/L为铁过载。在开展铁过载和饮酒联合暴露对肝功能影响的研究中将3133名男性研究对象分为非铁过载组(≤200μg/L)和铁过载组(＞200μg/L)，结合饮酒情况分为非饮酒和饮酒组，将研究对象分为非铁过载和非饮酒组(n=1756)，铁过载和非饮酒组(n=178)，非铁过载和饮酒组(n=1033)及铁过载和饮酒组(n=166)，收集人口学，身高、体重、血糖、血脂、血压、尿酸等生化检测信息；运用相加模型分析铁过载和饮酒交互作用对肝功能异常的影响。
海兔素补充干预的动物实验研究。酒精性肝损伤动物模型建立，选择SPF级成年雄性Wistar大鼠60只，体重180-220g，随机分为正常对照组、酒精模型组、海兔素对照组、海兔素+酒精组，每组各15只。其中，酒精模型组给予56%(v/v)乙醇8mL?(kg?1?d?1)灌胃2周后，12mL?(kg?1?d?1)灌胃6周；海兔素+酒精组给予150mg?(kg?1?d?1)海兔素灌胃，酒精灌胃方式同模型组；正常对照组和酒精模型组均给予5mL?(kg?1?bw?1?d?1)大豆油灌胃，实验持续8周。末次灌胃后，用代谢笼收集各组大鼠粪便，禁食12小时，3%戊巴比妥钠3mL/kg腹腔麻醉，腹主动脉取血，并留取肝脏和小肠标本。采用HE染色和透射电镜观察大鼠肝组织病理学改变和肝细胞超微结构变化，检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性；以及检测血浆白细胞介素IL-1β，IL-6，IL-10，转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平等。检测各组大鼠血浆中内毒素、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-LA)及肠脂肪酸结合蛋白(FABP2)水平；采用16SrDNA高通量测序方法检测海兔素补充干预对实验大鼠肠道微生态的影响，分析和了解小肠病理学和肠道屏障功能的变化。在此基础上，建立酒精和铁过量联合暴露模型及其对肠道菌群影响研究。选择SPF级成年雄性Wistar大鼠40只，体重180-220g，随机分为正常对照组、酒精+铁过量组、海兔素对照组、海兔素+酒精+铁过量组，每组各10只。正常对照组饲喂含铁量50mg/kg的基础饲料，酒精和铁过量组饲喂含铁量1000mg/kg饲料，同时给予56%(v/v)乙醇8mL?(kg?1?d?1)灌胃2周后，12mL?(kg?1?d?1)灌胃10周；海兔素对照组和海兔素+酒精+铁过量组给予150mg?(kg?1?d?1)海兔素灌胃；正常对照组和酒精+铁过量组给予5mL?(kg?1?bw?1?d?1)大豆油灌胃，实验持续12周。检测各组大鼠血清铁(SI)、铁蛋白(SF)、铁调素(HEPC)水平和肝组织铁(LIC)含量；分析大鼠十二指肠二价金属离子转运蛋白1(DMT1)和膜铁转运蛋白1(FPN1)表达水平。观察大鼠小肠组织病理学改变和小肠黏膜组织超微结构变化，检测各组大鼠血浆中内毒素，DAO、D-LA、FABP2水平；采用荧光实时定量PCR法检测各组大鼠粪便中双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、粪肠球菌、柔嫩梭菌和脆弱拟杆菌的含量。
结果
流行病学横断面调查研究显示。成年人群血清铁蛋白水平增高可增加肝功能异常的发病风险。多因素logistic回归结果表明(调整了混杂因素后)，高铁蛋白组肝功能异常的发病风险是低铁蛋白组的2.96倍(95% CI：1.74-5.02)(P＜0.05)；男性和女性发病风险分别是1.88倍(95% CI：1.20-2.96)和4.18倍(95% CI：1.74-10.05)((P＜0.05)。铁过量组肝功能异常率(12.5%)显著高于铁缺乏组(1.0%)和铁正常组(3.1%)(P＜0.05)。进一步分析成年男性铁过载和饮酒对肝功能异常的影响，经多因素logistic回归分析(调整了混杂因素后)，结果显示成年男性铁过载和饮酒人群发生肝功能异常的风险分别是正常人群的5.12倍(95% CI：3.06-8.57)(P＜0.05)。交互作用分析结果显示铁过载和饮酒同时存在的效应为两因素单独存在时效应之和的1.36倍，由两者间的交互作用引起的肝功能异常患病危险性为1.10。
海兔素补充对酒精性肝损伤的动物实验研究，显示出具有较好的改善效果。海兔素补充可改善大鼠酒精性肝组织损伤；与正常对照组相比，酒精模型组出现肝损伤，发现明显的炎性细胞浸润，以及典型脂肪变性；而海兔素干预后，其肝小叶结构显示正常，肝索排列逐渐恢复整齐，组织结构趋向正常。透射电镜观察海兔素补充大鼠肝细胞核膜完整，胞浆脂滴数量减少，线粒体结构完整。肝功能分析显示，酒精模型组大鼠血清中ALT、AST和ALP的活性与正常对照组相比显著增加(P＜0.05)，而海兔素可有效抑制这些变化。TNF-α和TGF-β的水平分别显著提高1.9倍和1.2倍，而IL-10的水平降低了59.7%(P＜0.05)；补充海兔素后，TGF-β和TNF-α的水平相对酒精模型组分别下降37.0%和34.7%，而IL-10水平显著提高2.0倍(P＜0.05)。肠道黏膜结构分析显示，长期酒精暴露，肠绒毛明显受损，大量黏膜上皮细胞脱落,海兔素补充干预后，大鼠肠道黏膜组织结构逐渐恢复正常。与正常对照组相比，酒精模型组大鼠血浆内毒素，D-LA、DAO及FABP2水平均呈上升趋势；海兔素补充干预后其水平均呈降低趋势。酒精模型组大鼠肠道拟杆菌和乳酸菌丰度明显减少，梭菌属Ⅳ(ClostridiumⅣ)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)和Anaerostipes丰度明显升高，而海兔素干预使其丰度显著降低，增加普雷沃氏菌属(Prevotella)的丰度。
海兔素补充可显著改善酒精和铁过量联合暴露大鼠肠黏膜损伤及肠道菌群紊乱。经过12周酒精和铁过量暴露大鼠，与正常对照组相比，肠腺体和肠绒毛都明显受损，肠腔内可见大量脱落的黏膜上皮细胞；而海兔素干预能够显著改善上述病变；透射电镜观察显示酒精和铁过量(模型)组大鼠小肠微绒毛排列稀疏，大量微绒毛脱落，细胞连接结构不完整甚至消失；海兔素干预后上述病变得到明显改善。模型组大鼠SI、SF、LIC和HEPC水平较正常对照组均显著升高，小肠DMT1和FPN1蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)；与模型组相比，海兔素干预后大鼠铁代谢水平均呈降低趋势，十二指肠铁蛋白表达呈下调趋势，具有显著性差异(P＜0.05)。与正常对照组相比，模型组内毒素，D-LA、DAO及FABP2水平均呈上升趋势；但海兔素干预后，其水平均呈降低趋势。肠道菌群分析显示，与正常对照组相比，酒精和铁过量模型组大鼠粪便脆弱拟杆菌和大肠杆菌的数量显著升高，柔嫩梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数量都显著下降(P＜0.05)；海兔素干预后大鼠粪便大肠杆菌和脆弱拟杆菌数量显著降低；乳酸杆菌、柔嫩梭菌和双歧杆菌的数量都显著升高(P＜0.05)。
结论
1.本研究的成年人群(35-76岁)血清铁蛋白水平增高可增加肝功能异常的发病风险。
2.男性人群饮酒与铁过载(SF>200μg/L)发生肝功能异常的风险分别是无饮酒史和铁蛋白水平正常成人的5.12倍。
3.利用成功建立的酒精、酒精和铁过量联合暴露的大鼠动物模型，观察海兔素补充能有效地改善酒精暴露、酒精和铁过量联合暴露大鼠肝组织和肠道黏膜损伤，对恢复肠道屏障功能和肠道菌群紊乱具有积极作用。
铁负荷状况是指铁在机体内储备水平和满足机体生理功能及代谢需要的程度，铁缺乏和铁过载都会对健康产生不良影响。随着慢性疾病的发生和发展，铁过载检出率呈现逐年上升趋势，但尚未引起重视，相关研究较少。随着人们饮酒量和红肉摄入量(或使用铁补充剂)的不断增加，给人们的健康带来不良影响。本研究旨在分析成年人体内铁营养状况与肝功能异常的关系，评估铁过载和饮酒对肝功能异常的风险；在此基础上，建立酒精暴露、铁过量及其联合暴露诱导的肝损伤大鼠动物模型，观察海兔素(Aplysin)补充改善大鼠肝损伤和肠道微生态的效果及其可能的作用机制。为指导人群合理摄入富铁食物(或补充铁剂)和适量饮酒，有效地预防和控制肝损伤提供科学依据。
方法
本研究采用人群横断面调查和动物实验的方法进行研究。
横断面调查研究对象及分组。人群研究采用横断面调查的方法，选取青岛市两家医院2014年1月至2015年10月参加健康体检的35-76岁6858名成年人群作为研究对象，收集个人基本信息、生活方式、体格检查、生化检测等信息资料。将血清铁蛋白(SF)水平按最低铁负荷组(Q1)，中低铁负荷组(Q2)、中高铁负荷组(Q3)和最高铁负荷组(Q4)四分位进行分析。采用回归分析不同铁蛋白水平与肝功能异常的关系。在此基础上，参照世界卫生组织(WHO)推荐判断机体的铁营养状况的血清铁蛋白水平(SF)标准：SF＜15μg/L为铁缺乏；男性SF15-200μg/L和女性SF15-150μg/L为铁营养状况良好；男性SF＞200μg/L和女性SF>150μg/L为铁过载。在开展铁过载和饮酒联合暴露对肝功能影响的研究中将3133名男性研究对象分为非铁过载组(≤200μg/L)和铁过载组(＞200μg/L)，结合饮酒情况分为非饮酒和饮酒组，将研究对象分为非铁过载和非饮酒组(n=1756)，铁过载和非饮酒组(n=178)，非铁过载和饮酒组(n=1033)及铁过载和饮酒组(n=166)，收集人口学，身高、体重、血糖、血脂、血压、尿酸等生化检测信息；运用相加模型分析铁过载和饮酒交互作用对肝功能异常的影响。
海兔素补充干预的动物实验研究。酒精性肝损伤动物模型建立，选择SPF级成年雄性Wistar大鼠60只，体重180-220g，随机分为正常对照组、酒精模型组、海兔素对照组、海兔素+酒精组，每组各15只。其中，酒精模型组给予56%(v/v)乙醇8mL?(kg?1?d?1)灌胃2周后，12mL?(kg?1?d?1)灌胃6周；海兔素+酒精组给予150mg?(kg?1?d?1)海兔素灌胃，酒精灌胃方式同模型组；正常对照组和酒精模型组均给予5mL?(kg?1?bw?1?d?1)大豆油灌胃，实验持续8周。末次灌胃后，用代谢笼收集各组大鼠粪便，禁食12小时，3%戊巴比妥钠3mL/kg腹腔麻醉，腹主动脉取血，并留取肝脏和小肠标本。采用HE染色和透射电镜观察大鼠肝组织病理学改变和肝细胞超微结构变化，检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性；以及检测血浆白细胞介素IL-1β，IL-6，IL-10，转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平等。检测各组大鼠血浆中内毒素、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-LA)及肠脂肪酸结合蛋白(FABP2)水平；采用16SrDNA高通量测序方法检测海兔素补充干预对实验大鼠肠道微生态的影响，分析和了解小肠病理学和肠道屏障功能的变化。在此基础上，建立酒精和铁过量联合暴露模型及其对肠道菌群影响研究。选择SPF级成年雄性Wistar大鼠40只，体重180-220g，随机分为正常对照组、酒精+铁过量组、海兔素对照组、海兔素+酒精+铁过量组，每组各10只。正常对照组饲喂含铁量50mg/kg的基础饲料，酒精和铁过量组饲喂含铁量1000mg/kg饲料，同时给予56%(v/v)乙醇8mL?(kg?1?d?1)灌胃2周后，12mL?(kg?1?d?1)灌胃10周；海兔素对照组和海兔素+酒精+铁过量组给予150mg?(kg?1?d?1)海兔素灌胃；正常对照组和酒精+铁过量组给予5mL?(kg?1?bw?1?d?1)大豆油灌胃，实验持续12周。检测各组大鼠血清铁(SI)、铁蛋白(SF)、铁调素(HEPC)水平和肝组织铁(LIC)含量；分析大鼠十二指肠二价金属离子转运蛋白1(DMT1)和膜铁转运蛋白1(FPN1)表达水平。观察大鼠小肠组织病理学改变和小肠黏膜组织超微结构变化，检测各组大鼠血浆中内毒素，DAO、D-LA、FABP2水平；采用荧光实时定量PCR法检测各组大鼠粪便中双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、粪肠球菌、柔嫩梭菌和脆弱拟杆菌的含量。
结果
流行病学横断面调查研究显示。成年人群血清铁蛋白水平增高可增加肝功能异常的发病风险。多因素logistic回归结果表明(调整了混杂因素后)，高铁蛋白组肝功能异常的发病风险是低铁蛋白组的2.96倍(95% CI：1.74-5.02)(P＜0.05)；男性和女性发病风险分别是1.88倍(95% CI：1.20-2.96)和4.18倍(95% CI：1.74-10.05)((P＜0.05)。铁过量组肝功能异常率(12.5%)显著高于铁缺乏组(1.0%)和铁正常组(3.1%)(P＜0.05)。进一步分析成年男性铁过载和饮酒对肝功能异常的影响，经多因素logistic回归分析(调整了混杂因素后)，结果显示成年男性铁过载和饮酒人群发生肝功能异常的风险分别是正常人群的5.12倍(95% CI：3.06-8.57)(P＜0.05)。交互作用分析结果显示铁过载和饮酒同时存在的效应为两因素单独存在时效应之和的1.36倍，由两者间的交互作用引起的肝功能异常患病危险性为1.10。
海兔素补充对酒精性肝损伤的动物实验研究，显示出具有较好的改善效果。海兔素补充可改善大鼠酒精性肝组织损伤；与正常对照组相比，酒精模型组出现肝损伤，发现明显的炎性细胞浸润，以及典型脂肪变性；而海兔素干预后，其肝小叶结构显示正常，肝索排列逐渐恢复整齐，组织结构趋向正常。透射电镜观察海兔素补充大鼠肝细胞核膜完整，胞浆脂滴数量减少，线粒体结构完整。肝功能分析显示，酒精模型组大鼠血清中ALT、AST和ALP的活性与正常对照组相比显著增加(P＜0.05)，而海兔素可有效抑制这些变化。TNF-α和TGF-β的水平分别显著提高1.9倍和1.2倍，而IL-10的水平降低了59.7%(P＜0.05)；补充海兔素后，TGF-β和TNF-α的水平相对酒精模型组分别下降37.0%和34.7%，而IL-10水平显著提高2.0倍(P＜0.05)。肠道黏膜结构分析显示，长期酒精暴露，肠绒毛明显受损，大量黏膜上皮细胞脱落,海兔素补充干预后，大鼠肠道黏膜组织结构逐渐恢复正常。与正常对照组相比，酒精模型组大鼠血浆内毒素，D-LA、DAO及FABP2水平均呈上升趋势；海兔素补充干预后其水平均呈降低趋势。酒精模型组大鼠肠道拟杆菌和乳酸菌丰度明显减少，梭菌属Ⅳ(ClostridiumⅣ)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)和Anaerostipes丰度明显升高，而海兔素干预使其丰度显著降低，增加普雷沃氏菌属(Prevotella)的丰度。
海兔素补充可显著改善酒精和铁过量联合暴露大鼠肠黏膜损伤及肠道菌群紊乱。经过12周酒精和铁过量暴露大鼠，与正常对照组相比，肠腺体和肠绒毛都明显受损，肠腔内可见大量脱落的黏膜上皮细胞；而海兔素干预能够显著改善上述病变；透射电镜观察显示酒精和铁过量(模型)组大鼠小肠微绒毛排列稀疏，大量微绒毛脱落，细胞连接结构不完整甚至消失；海兔素干预后上述病变得到明显改善。模型组大鼠SI、SF、LIC和HEPC水平较正常对照组均显著升高，小肠DMT1和FPN1蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05)；与模型组相比，海兔素干预后大鼠铁代谢水平均呈降低趋势，十二指肠铁蛋白表达呈下调趋势，具有显著性差异(P＜0.05)。与正常对照组相比，模型组内毒素，D-LA、DAO及FABP2水平均呈上升趋势；但海兔素干预后，其水平均呈降低趋势。肠道菌群分析显示，与正常对照组相比，酒精和铁过量模型组大鼠粪便脆弱拟杆菌和大肠杆菌的数量显著升高，柔嫩梭菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数量都显著下降(P＜0.05)；海兔素干预后大鼠粪便大肠杆菌和脆弱拟杆菌数量显著降低；乳酸杆菌、柔嫩梭菌和双歧杆菌的数量都显著升高(P＜0.05)。
结论
1.本研究的成年人群(35-76岁)血清铁蛋白水平增高可增加肝功能异常的发病风险。
2.男性人群饮酒与铁过载(SF>200μg/L)发生肝功能异常的风险分别是无饮酒史和铁蛋白水平正常成人的5.12倍。
3.利用成功建立的酒精、酒精和铁过量联合暴露的大鼠动物模型，观察海兔素补充能有效地改善酒精暴露、酒精和铁过量联合暴露大鼠肝组织和肠道黏膜损伤，对恢复肠道屏障功能和肠道菌群紊乱具有积极作用。