大黄鱼Cystatin F在毕赤酵母中发酵表达和纯化工艺研究

• 作 者: 赵建博
• 出 处: 福建农林大学
• 发表日期: 2016年01期
• 关键词: 毕赤酵母 Cystatin F 蛋白质纯化

鱼糜制品是水产品深加工的主要产品之一,不但可以直接作为餐饮业的食品原料,同时它还是一种重要的食品制造业原辅料。但是由于鱼糜本身所含蛋白酶的影响,其加工过程中常常会造成凝胶劣化,对鱼糜制品行业的发展造成不良影响。目前,抑制鱼糜凝胶劣化的方法主要有:改进漂洗工艺、改变加热方式、添加淀粉等,但是以上几种方法不但效果较差,同时还会影响产品风味和色泽,其应用受到很大限制。Cystatin F是一种半胱氨酸类蛋白酶抑制剂,在机体免疫调控中具有重要作用。本实验室前期研究结果显示,来源于我国重要海水经济鱼类-大黄鱼的半胱氨酸蛋白酶抑制剂F(Large yellow croaker Cystatin F,LycCysF)的重组表达产物能有效抑制大黄鱼半胱氨酸类组织蛋白酶B、L、S以及木瓜蛋白酶Papain、Legumian的蛋白酶活性,可有效抑制在鱼糜加工过程中由组织蛋白酶造成的凝胶劣化现象,同时能够增加鱼糜凝胶强度、弹性、硬度、咀嚼性、白度和持水性能,具有较大的应用前景。本研究在实验室前期获得表达Cystatin F的高效基因工程菌GS115/pPIC9K-Op2CysF的基础上,对该工程菌的发酵条件进行优化。首先在摇瓶水平对最佳诱导pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间等发酵条件进行研究,确定其最佳诱导pH值为4.8,在对其进行诱导表达过程中应控制培养基中甲醇浓度在1%-2%以下,最佳诱导表达时间为72h。在此基础上,又在5L、50L发酵罐对利用发酵罐发酵生产Cystatin F进行研究。最终,在单因素实验及小规模发酵罐发酵的基础上建立了利用1吨发酵罐发酵生产Cystatin F的流程及参数,发酵结束后测得上清总蛋白含量为503 mg/L,其中目的蛋白占总蛋白比例为18.7%,目的蛋白表达量为94.1mg/L,为Cystatin F的规模化生产和进一步推广应用奠定基础。其次,在大规模发酵体系建立的基础上,又对Cystatin F的大规模纯化方法进行了研究。通过对离子交换层析、凝胶过滤层析、硫酸铵沉淀和亲和层析等蛋白质纯化方法的研究,最终建立了从发酵液中大规模纯化Cystatin F的流程及方法。该方法在结束发酵之后,用NaOH调节发酵液pH至7.4,离心得到发酵上清液,利用Vivaflow 50切向流过滤器对上清液进行浓缩,利用Sephadex G-25对浓缩液进行脱盐处理,后采用亲和层析的方法利用Ni柱对目的蛋白进行纯化。按照该方法对发酵液中Cystatin F进行纯化,纯化结束后测得目的蛋白回收率为71.2%，该方法具有操作简便、易于放大、回收率高等特点,为CystatinF的进一步开发应用和大规模工业化生产奠定了基础。本研究也首次提出利用重组大黄鱼Cystatin F控制鱼肉制品加工以及鱼糜制品加工过程中凝胶劣化的观点,本着“取之于鱼,用之于鱼”的经济、环保理念,为控制鱼肉蛋白降解以及鱼糜凝胶劣化问题,提高鱼糜制品质量,提供了一套科学的解决方法。