论文部分内容阅读
几丁质(chitin)是N-乙酰氨基葡萄糖的同聚物，在昆虫生长发育的各个时期，几丁质的含量和分布都需要相应发生变化。几丁质酶(chitinase)属水解酶类，能够将几丁质长链降解为寡聚物。昆虫几丁质酶存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中，表达水平随昆虫不同生长发育阶段而变化，对昆虫几丁质的代谢起重要调控作用。 为了得到鞘翅目特异性几丁质酶基因，本研究免疫筛选已构建的暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela Motschulsky)中肠cDNA表达文库，得到暗黑鳃金龟几丁质酶基因，命名为hpChi，并对其特性进行分析。hpChi基因全长1591bp，开放读码框(ORF)1443bp，编码480个氨基酸，预测的分子量大小为51.4kDa，等电点(pI)为5.08。氨基酸序列分析显示其具有3个区域组成的多功能区结构，分别为N-端的酶活性催化区（catalytic domain），C-端富含半胱氨酸的几丁质结合区(chitin-binding domain，CBD)及富含丝氨酸和苏氨酸的连接区(Linker)。 利用PDB网站对HpChi蛋白的结构进行预测，表明HpChi蛋白具有几丁质酶第18家族（Family18）典型的“(β/α)8圆桶型结构”。利用NCBI网站和MEGA软件构建系统发育树，结果显示暗黑鳃金龟几丁质酶HpChi与近缘种的华北大黑鳃金龟亲缘关系最近，其次与直翅目东亚飞蝗（Locusta migratoriamanilensis）和鞘翅目赤拟谷盗（Tribolium castaneum）亲缘关系较近，与鞘翅目昆虫黄粉虫（Tenebrio molitor）、墨松天牛（Monochamus alternatus）、辣根猿叶甲（Phaedoncochleariae）统属一大类，与膜翅目和鳞翅目昆虫亲缘关系较远。 构建原核重组表达载体pET30a-hpChi，转化大肠杆菌BL21。诱导表达并优化表达条件，经SDS-PAGE电泳和Western Blot分析，成功表达分子量51.4kDa的几丁质酶蛋白，与预测结果相符。将以包涵体形式存在的外源蛋白HpChi超声破碎后，通过Ni+-NTA树脂亲和层析纯化蛋白，并制备多克隆抗体。 构建重组酵母表达载体pPICK9K-hpChi，转化缺陷性毕赤酵母GS115，经抗性筛选、表型和分子鉴定表明重组酵母GS115（pPICK9K-hpChi）构建成功。但甲醇诱导表达后，Western Blot检测未能成功表达目的蛋白。 构建真核（重组杆状病毒）表达载体pFast-hpChi，转化大肠杆菌DH10Bac，利用其载体自带质粒转座将目的基因插入Bacmid杆状病毒进一步构建得到Bacmid-hpChi。转染昆虫细胞（草地贪夜蛾细胞系sf9），分别获得P1、P2、P3病毒，取上清进行Western Blot检测，证明HpChi在昆虫细胞sf9中获得成功表达。以几丁质为底物通过DNS比色检测还原糖的原理测定细胞表达的几丁质酶的酶活，结果显示其有几丁质酶的活性并且在微酸环境下活性较强。 本研究通过对暗黑鳃金龟幼虫（蛴螬）几丁质酶生物信息学分析和活性测定，为深入了解鞘翅目昆虫几丁质酶生物学功能提供理论依据，也为其生物防治提供参考。