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【研究背景及目的】结节病（sarcoidosis）是一种系统性疾病,以非干酪性上皮样肉芽肿为主要病理特点,最常累及肺和胸部淋巴结[1]。结节病的病因和发病机制尚不清楚,研究认为结节病是一种细胞免疫的异常反应,可能与结核分枝杆菌、尘埃以及痤疮丙酸杆菌相关[2-3]。以往研究证明结节病是一种以1型T辅助细胞（Th1）免疫反应为主的疾病[4]。当未知抗原被肺泡巨噬细胞识别,呈递给Th1,并刺激增殖和产生大量炎症介质如IL-2、IFN-γ、肿瘤坏死因子-α,随即上皮样巨噬细胞、巨噬细胞和淋巴细胞主要是CD4+T细胞聚集,形成非干酪样坏死的肉芽肿[5]。随着人们对CD4+T细胞的进一步研究,逐步发现两种CD4+T细胞亚群（辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg））也参与了结节病的发病过程。Th17细胞是CD4+T细胞一种亚型,其特征性转录因子是视黄酸相关孤核受体γt（retinoic acid-related orphan receptorsγt,RORγt）,而IL-17则是其最重要的细胞分泌因子。Treg是对免疫应答起负调节作用的一种CD4+T细胞亚群,主要分泌IL-10、TGF-β,Foxp3是Treg细胞的特异性转录因子。在TGF-β单独诱导下CD4+T细胞可分化为Treg细胞,在IL-6、TGF-β的共同诱导下分化为Th17细胞,Th17细胞主要通过产生IL-17等细胞因子促进炎症反应,而Treg细胞起着免疫抑制作用,二者相互制约平衡。有研究对活动期结节病患者的外周血和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）进行检测,发现其中Th17细胞数量增多,并且在结节病肉芽肿的中心部位可见Th17细胞的聚集,提示Th17细胞可能参与了结节病肉芽肿的形成过程[5-6]。大多数研究认为结节病中Th17分化增强[5、7、8],而Treg在结节病中的作用变化则存在比较大的分歧[9-12]。Idali等[13]研究发现结节病患者活动期外周血和BALF中Treg细胞在数量、细胞因子以及mRNA表达上均低于对照组患者。而有研究得到的是相反的结果,发现Treg细胞数在患者BALF和外周血中表达增加[10]。有研究[14]发现,在结节病患者经过糖皮质激素治疗后Th17、Th17/Treg显著降低。随着细胞以及分子生物学技术的应用,人们对结节病的免疫发病机制有了更深的认识,但是在对其高效安全的治疗方法领域还未取得突破性的进展。结节病目前尚无根治性治疗方法,糖皮质激素仍是首选治疗[15],常用的二线治疗药物包括甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺等细胞毒性药物。但长期使用糖皮质激素或者二线药物均可带来严重的不良反应[16],因此,寻找其他副作用更少的新药来替代或联合糖皮质激素等药物达到更有效治疗结节病的目的,是目前结节病治疗的研究方向。结合结节病发病的免疫机制,我们认为,寻找一个能干预结节病免疫调节的药物可能成为结节病药物治疗的一个突破口。我们课题组在前期的临床实践过程中发现,胸腺肽皮下注射治疗结节病能产生非常明显的治疗效果,2例不能耐受激素治疗的结节病患者经过皮下注射胸腺肽α1（Tα1）,肿大的纵隔及肺门淋巴结明显缩小或消退,临床症状完全缓解,这引发了我们对Tα1治疗结节病机制进行研究的兴趣。Tα1是在1966年从小牛胸腺中分离纯化得到的一种活性肽[17],主要来源于胸腺上皮细胞和胸腺内分泌细胞,此外在脾、淋巴结、肺、脑等组织中也有发现[18]。Tα1能够提高T细胞对抗原的反应能力、维持免疫平衡,从而提高机体抵抗力。Tα1作为免疫调节剂[19],可通过多种机制作用于免疫系统中,Tα1可以促进T细胞的成熟[20],可以提高T细胞产生特定细胞因子的能力,也可以增加Treg细胞比例[21],已被广泛用于多种疾病的治疗,如肿瘤、重症感染、病毒性肝炎等[22-24],但是目前还没有关于Tα1应用在结节病治疗中的报道。为了进一步探究Tα1在结节病治疗中发挥作用的可能机理,本课题拟在细胞水平研究的基础上,构建小鼠肺结节病模型,并用Tα1对模型小鼠进行治疗干预,通过病理和各项免疫学指标的检测,初步验证Tα1对结节病小鼠的治疗效果,为结节病药物治疗的探索创新提供一定的参考。【实验方法】第一部分Tα1对外周血单个核细胞的干预作用1、不同浓度Tα1对小鼠外周血单个核细胞（PBMC）的干预作用用不同浓度的Tα1（0、5ug/ml、10ug/ml）对小鼠外周血单个核细胞干预48小时,流式细胞术检测Th17、Treg细胞比例。2、不同浓度Tα1对人外周血单个核细胞的干预作用用不同浓度的Tα1（0、5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml）对人外周血单个核细胞干预48小时,流式细胞术检测Th17、Treg细胞比例。第二部分C57BL/6小鼠结节病肉芽肿模型的构建10只C57BL/6小鼠随机分为2组:空白对照组5只、模型组5只。第1天:模型组给予50ugSod A与不完全弗氏佐剂（Incomplete freund’s adjuvant,IFA）0.25ml混合后皮下注射;空白对照组给予0.5ml PBS皮下注射。第14天:模型组给予偶联的50ugSod A、6000粒琼脂糖珠0.5ml尾静脉注射;空白对照组给予PBS0.5ml尾静脉注射。第22天:将小鼠处死,解剖小鼠,观察肺、淋巴结大体标本和组织学改变;免疫组化检测肉芽肿中CD4+T细胞和巨噬细胞;流式细胞术检测外周血和BALF中Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8的比例以及肺组织IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10的水平。PCR检测小鼠肺组织RORγt、Foxp3的mRNA的表达水平。第三部分Tα1治疗结节病机制的初步研究Tα1对模型小鼠的干预治疗:第1-22天:10只C57BL/6小鼠参照第一部分进行模型构建第22-35天:将10只小鼠随机分成两组,模型组5只,给药组5只。给药组每天给予10ug Tα1腹腔注射;模型组每天给予0.5ml PBS腹腔注射。第36天:处死小鼠。解剖小鼠,观察肺、淋巴结大体标本和组织学改变;流式细胞术检测外周血和BALF中Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8和肺组织IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10的水平。PCR检测小鼠肺组织RORγt、Foxp3的mRNA的表达水平。小鼠体外实验:用不同浓度的Tα1对从小鼠外周血分离得到的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）干预48小时,流式细胞检测Th17、Treg细胞比例。临床1例接受胸腺肽α1治疗的结节病患者的胸部CT和外周血Th17/Treg监测。【研究结果】第一部分Tα1对外周血单个核细胞的干预作用1、不同浓度Tα1对小鼠外周血单个核细胞的干预作用不同浓度的Tα1（0、5ug/ml、10ug/ml）对小鼠外周血单个核细胞干预后,Th17细胞占CD4+T细胞比例随着Tα1浓度的增加而减低,而Treg细胞占CD4+T细胞比例随着Tα1浓度的增加而增加,各组间具有统计学差异。2、不同浓度Tα1对人外周血单个核细胞的干预作用不同浓度的Tα1（0、5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml）对人外周血单个核细胞干预后,Th17细胞占CD4+T细胞比例随着Tα1浓度的增加而减低,具有统计学差异;Treg细胞占CD4+T细胞比例组间则无统计学差异。第二部分C57BL/6小鼠结节病样肉芽肿模型的构建1、模型组小鼠肺组织切片经HE染色可见大量淋巴细胞浸润,形成多个大小不等的以类上皮细胞为中心、淋巴细胞围绕的非干酪性肉芽肿;空白对照组小鼠对照组肺泡、肺间质结构正常,未见淋巴细浸润及肉芽肿。2、免疫组化显示模型组小鼠巨噬细胞特异性抗原Mac-2在肉芽肿中心表达,CD4+T细胞在其周围表达。3、模型组小鼠外周血Th1占CD4+T细胞比例高于空白对照组（P<0.05）;Th17占CD4+T细胞比例显著高于空白对照组（P<0.01）;模型组和对照组间Treg占比、CD4/CD8比例没有显著差异;模型组和对照组Th1/Th2比值没有统计学差异,但是模型组Th1/Th2比值相比空白对照组有增高的趋势;模型组Th17/Treg比值明显高于空白对照组（P<0.05）。4、小鼠BALF中Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8比例以及Th17/Treg比值、Th1/Th2比值组间均无统计学差异。（表）5、模型组小鼠血浆中因子IL-17A显著高于空白对照组（P<0.05）,IL-6组间无显著差异;血浆因子TGF-β模型组低于对照组（P<0.05）、IL-10模型组显著低于对照组（P<0.01）。6、模型组小鼠肺组织中因子IL-17A显著高于空白对照组（P<0.01）,IL-6模型组高于对照组（P<0.05）;TGF-β和IL-10两组组间无显著统计学差异。7、模型组小鼠肺组织中RORγt的mRNA的表达水平高于对照组（p<0.05）;Foxp3的mRNA的表达水平组间无统计学差异,但模型组有降低的趋势。第三部分Tα1治疗结节病机制的初步研究1、模型组小鼠支气管基底膜增厚,肺泡大小不一并有破坏,可见大量淋巴细胞浸润,形成多个大小不等的以类上皮细胞为中心、淋巴细胞围绕的非干酪性肉芽肿;给药组小鼠肺泡大小不一,偶见肉芽肿形成,可见淋巴细胞浸润较模型组减少。2、模型组和给药组小鼠外周血中Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8比例以及Th17/Treg比值、Th1/Th2比值组间均无统计学差异。3、模型组和给药组小鼠BALF中Th1、Th2、Th17、Treg、CD4/CD8比例以及Th17/Treg比值、Th1/Th2比值组间均无统计学差异。4、给药组小鼠血浆中IL-17A浓度显著低于模型组（p<0.05）,IL-6组间无显著差异;TGF-β和IL-10两组组间无显著性差异。5、模型组和给药组小鼠肺组织中因子IL-17A、IL-6、TGF-β、IL-10浓度各组间无显著差异。6、给药组小鼠肺组织中RORγt的mRNA的表达水平低于模型组（p<0.05）;Foxp3的mRNA的表达水平组间无显著性差异。7、临床1例接受胸腺肽α1治疗的结节病患者临床症状缓解,胸部CT监测显示淋巴结逐渐缩小,Th17占CD4+T细胞比例、Th17/Treg比值存在下降趋势。【结论】1、Tα1在体外可上调Th17,调节Th17/Treg平衡;2、利用Sod A作为免疫原可成功构建C57BL/6结节病肉芽肿模型,其病理、免疫特征符合结节病相关特点;3、Tα1对结节病肉芽肿模型小鼠有一定的治疗改善作用;4、Tα1可调节结节病模型小鼠的免疫失衡。