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RNA干涉（即RNAi）是通过导入一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）序列，使内源靶基因中同源mRNA降解，从而达到阻抑基因表达目的的方法。大量实验证明，RNAi是研究动植物基因功能的一个强有力的工具。RNAi现象最初是Andrew Fire等（Andrew Fire，et al，1998）在秀丽线虫中发现的。后来，人们发现RNAi现象存在于许多生物体中，包括从真菌乃至动植物。目前已在线虫等生物中建立RNAi技术。这项技术对难于获得突变体的基因或生物体尤其有效。家蚕作为重要的经济昆虫，其基因组研究正在推进。有关RNAi在家蚕中的应用研究，日本农业生物资源研究所的全国兴等（G．X．Quan et al，2002）用Bmwh3基因作为材料初步证实了RNAi技术可以在家蚕中起作用。RNAi可以作为家蚕基因功能分析的一个重要工具。 家蚕卵色正常型为黑褐色，白卵为其突变类型，第三白卵基因（Bmwh3）为该类突变基因之一。在正常型蚕卵胚盘形成前期注射与家蚕Bmwh3基因的dsRNA可诱导产生与第三白卵（10～19.6）相似的突变表型，这种突变体的特征是卵不着色，呈现白卵且蚁蚕皮肤呈半透明。为在家蚕胚胎发育时期建立有效的RNAi分析技术，本文在前人的基础上以家蚕Bmwh3为材料，探讨了不同导入方法对RNA干涉的影响及RNAi在华系大造品种中的运用，并比较了两种导入剂量和两种导入时间的RNA干涉效果的差异。结果发现，以微量注射法在产卵后8小时注射以并以9.2nl／粒（5.9ug／ul）的剂量向家蚕胚胎中导入Bmwh3dsRNA，能有效的诱导第三白卵突变表型。具体结果如下： 1．首先，本实验确认了在家蚕胚胎胚盘形成前期注射Bmwh3基因dsRNA的效果。注射Bmwh3基因的dsRNA诱导蚕卵不着色或形成嵌合体卵，类似于家蚕第三白卵的突变体；而注射Bmwh3基因原质粒和ddH2O却没有导致白卵或嵌合体表型，不影响该基因的正常表达。野生型的家蚕，由于眼色素的积累，蚕卵和蛾眼眼色都是深褐色。向蚕胚胎注射Bmwh3基因dsRNA后，导致胚胎细胞中同源mRNA降解，使内源基因不表达或表达不完全，导致浆液膜不含色素或色素极少，从而使蚕卵不着色。 2．RNAi可在不同的蚕品种中发挥作用。全国兴等（G．X．Quan et al,2002）以卵色正常的日系品种N200蚕卵作为实验材料，用RNAi技术成功地诱导了第三白卵突变表型的产生。本实验用正常卵色的华系二化性品种大造蚕卵作为注射材料，也得到了类似的结果。 3．分别采用了微量注射法和精子介导法两种导入方法将Bmwh3基因的dsRNA导入蚕卵内。结果表明，用微量注射法可以诱导家蚕第三白卵突变表型的产生，这说明川微量注射法能够将足够的dSRNA导入蚕卵内：而用精子介导法则基本不能诱导蚕的RNAi表型，从量上分析，每头雌蛾的受精囊中注射了SSI浓度为0．1二S咖似dS RNRNA原液浓度5．gsgl山稀释倍数扣X计算)的dS RNRNA。如果所有的dSRNA均平均进入每粒蚕卵内，以每蛾产卵300粒计算，则每粒蚕卵中进入dSRNA的量约为ZX＊个分子，比全国兴等人（QX．QUm幻of2002）的实验中所采用的注射量大2倍左右。理论上讲，我们的注射量是足以诱导RNA干涉效果产生的，但事实上并未得到理想结果。由此可以推测，dsRNA导人雌蛾受精囊后未能随精子进入卵内，因此不能诱导RNAi表型的产生。 4．为了探讨不同时间和不同剂量注射对干涉效果的影响，我们分别采用了两个注射时间，即产卵后 8 ．J’时和 20 ，J’时；两种注射剂量 4．6nil粒和 9．Znl／粒，注射浓度均7J 5．gug／UI。结果表明，产卵后8’J’时注射Bmsh三基因dSRNA有效地诱导产生了白卵突变表型，而产卵后20．J＼时注射的蚕卵均着色正常，无干涉现象的产生。从家蚕胚胎发育过程看，产卵 121 5小时为胚盘形成期，而 20小时后则胚盘己完全形成。卵色是由母性遗传物质所控制的，胚盘一旦形成，卵色就能止常表达。由下dsRNA介导的基因干涉是属于转录后基因沉默，dsRNA导入后导致细胞中同源mRNA降解，从而干扰其内源基因的表达。因此，从利用不同注射时间对干涉效果的影响结果：胚盘一旦形成，Bmwh3基因就开始正常表达。此时转运蛋自己经开始合成并发挥其相应功能，参与眼色素的合成并转运至卵可以而使卵着色。因此，在产卵 15小时以后注射 Bmwh3基因的 dsRNA就不能诱导产生白卵突变现象。从实验结果中还可以看出，注射 4．6nV粒和 9二＊ 两种注射剂量中未着色卵和嵌合体卵出现的频率后者略高于前者。