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本研究获全军“十五”医学科研基金重点课题(01Z011)
和江苏省青年科技基金(BK99158)资助
内毒素诱导肝细胞白蛋白表达下降的分子机制感染病人的低白蛋白血症是临床上的常见问题，而且低白蛋白血症与病人的病情严重度和预后密切相关。我们曾就感染病人的低白蛋白血症的发生机理进行过系列研究，结果表明：感染病人的低白蛋白血症与白蛋白合成减少、白蛋白的分布和分解异常都有密切的关系。在感染的急性期，白蛋白快速从血管内向血管外分布是白蛋白浓度快速下降的主要原因，而慢性感染病人，白蛋白合成减少是低白蛋白血症的主要原因。
前期研究中，我们观察到大鼠腹腔感染后，白蛋白mRNA表达显著下降，白蛋白mRNA的变化与门脉血内毒素的升高明显相关，提示内毒素是影响肝细胞白蛋白mRNA表达的重要因素。然而，内毒素诱导的肝细胞白蛋白表达抑制的机理不清楚。因此，本研究在前期研究的基础上，1、进一步证实内毒素对体外培养肝细胞白蛋白表达的影响；2、进一步探讨内毒素抑制肝细胞白蛋白表达的作用机理，包括与细胞因子的关系、涉及的细胞内信号传导通路和核转录因子的激活。研究结果将进一步阐明感染时肝脏白蛋白合成下降的分子机理，为研究感染时肝脏急性相反应及低白蛋白血症的治疗探索提供了理论和方法学基础。
1、高纯度大鼠原代肝细胞分离培养方法的建立采用的原位灌注消化法由Berry和Friend于1969年报道，后经Seglen等人的改进，目前包括两个原位灌注的步骤。前后两次灌注的液体分别为含有EGTA的D-Hanks液及含有DNaseⅠ的胶原酶消化液，分离细胞经3次低速离心(50g×5min)后可获得纯化的肝细胞。与传统的原代肝细胞培养方法相比，观察两种方法获得的肝细胞的活率及纯度。肝细胞活力的检测使用苔盼蓝拒染法，纯度检测使用苏木素-伊红染色。结果发现：平均每只200g-300g的大鼠通常可以获取1.0-1.5×108的细胞，活力大于50％。同时获取的肝细胞纯度高于98％，光镜下肝细胞呈多边形或圆形，胞浆丰富可见空泡，胞核中等大小、多偏位，可见单核、双核甚至多核。采用RPMI1640培养基培养分离得到的肝细胞，培养基中加入特殊营养成分以利于肝细胞的生长。细胞培养于6孔板中，培养密度为5×105个/ml。培养条件为50％CO2的37℃孵箱，稳定培养2天后换入新鲜培养基。动态观察培养5d中肝细胞的活率及形态的变化。结果发现：培养1、3、5天肝细胞的活率分别为100％、97.5％、93.4％。形态良好，无明显改变。结论：采用改良的原位灌注消化法能获得较高的产率及活性，同时保持良好的肝细胞形态及功能。本研究为研究肝脏急性相反应提供了成熟、稳定的高纯度原代肝细胞的分离培养方法。
2、大鼠白蛋白基因片段的克隆及其mRNA半定量检测方法的建立白蛋白mRNA已被证实是反映白蛋白合成变化的重要指标。利用一步法逆转录聚合酶链反应方法(AccessRT-PCR)从大鼠原代肝细胞中成功的扩增出白蛋白基因片段，并将其连接到pGEM-T载体中，经ABIPRISM377型全自动核苷酸分析仪检测。扩增的基因片段经DNA序列分析由401个碱基组成，序列与Genebank报导的大鼠白蛋白mRNA序列完全相同。同时实验以管家基因β-ACTIN为内对照，可以对扩增出的白蛋白片段进行严格的半定量分析。结论：成功克隆出大鼠白蛋白基因片段，建立了稳定的白蛋白mRNA半定量检测方法。
3、观察内毒素对体外培养肝细胞白蛋白表达的影响通过预试验选用终浓度1μg/ml的内毒素处理肝细胞，分别于0，2，8，12和24小时检测白蛋白的mRNA，同时留取细胞检测肝细胞内白蛋白前体的水平及细胞上清检测白蛋白浓度。用逆转录聚合酶链反应观察内毒素处理后0，2，8，12和24小时肝细胞白蛋白mRNA的水平，结果发现直至内毒素处理后24小时白蛋白mRNA才出现明显的下降(下降约30％)。使用流式细胞仪检测肝细胞胞浆内白蛋白前体的合成变化，结果发现其蛋白表达的变化与mRNA的改变一致。用酶链免疫反应检测分泌到肝细胞外的白蛋白浓度，其变化与mRNA、胞浆内白蛋白的改变一致(下降50％)。结论：1、体外培养肝细胞白蛋白的表达下降出现在内毒素作用后的24小时，2、白蛋白的mRNA、胞内及胞外白蛋白水平均受到内毒素不同程度的抑制但变化是一致的，说明内毒素通过在转录水平抑制白蛋白mRNA的表达来抑制肝细胞白蛋白的合成。
4、内毒素介导白蛋白表达下降与细胞因子的关系为了明确白蛋白mRNA下降滞后的原因，我们选用环己酰亚胺作为工具药。环己酰亚胺是一种蛋白合成抑制剂，可以抑制内毒素诱导的其他蛋白如细胞因子的合成，因此环己酰亚胺的预处理可以去除培养体系中内毒素介导的中间蛋白包括细胞因子的影响，进而明确内毒素诱导的白蛋白的下降是否依赖于细胞因子的介导。结果发现用1μg/ml的内毒素刺激肝细胞24小时后白蛋白mRNA有明显的下降，环己酰亚胺的预处理可以阻断白蛋白mRNA表达的下降。而且随着环己酰亚胺剂量的增加，这种阻断作用也越来越明显。结论：内毒素可通过某种中间蛋白可能为细胞因子来间接抑制肝细胞白蛋白mRNA的表达。
5、内毒素介导白蛋白表达下降的信号传导通路我们发现内毒素处理后24小时，肝细胞上清中白蛋白水平下降约50％。使用常见的信号蛋白的特异性阻断剂来观察与内毒素诱导的白蛋白表达下降有关的信号通路。应用细胞内信号蛋白p38激酶、ERK激酶及核蛋白NF-κB特异性阻断剂SB203580、PD98059和SN50处理后检测细胞上清中白蛋白浓度的变化。结果发现：SB203580、PD98059和SN50均可以不同程度地抑制白蛋白表达的下降。结论：内毒素诱导肝细胞白蛋白表达的下降与细胞内信号通路p38、ERK和NF-κB密切相关，进一步明确了感染时低白蛋白血症相关的信号传导通路。
6、内毒素介导白蛋白表达下降与NF-κB活化的关系核转录因子NF-κB涉及到多个炎症反应的基因转录。实验五提示NF-κB与内毒素诱导的白蛋白表达下降有关，本实验进一步明确内毒素是否介导了肝细胞NF-κB的活化。EMSA检测内毒素处理24h后NFκB的活性，结果发现正常对照组NF-κB有较低水平的表达，1ng/ml、1μg/ml内毒素处理后24h的时相点肝细胞内NF-κB活性明显增强，1μg/ml内毒素组肝细胞核内核因子-κB活性明显高于1ng/ml处理组的水平。结果表明核转录因子NF-κB参与了感染时肝脏的急性相反应，NF-κB的活化是内毒素诱导肝细胞白蛋白表达下降的重要原因。
本学位论文所取得的创造性科研成果：1、在国内率先使用改良原位灌注法及低速离心的方法分理出高纯度的原代大鼠肝细胞。2、建立了一种稳定、可靠的白蛋白mRNA的半定量检测办法。3、在体外，系统观察到了内毒素对肝细胞白蛋白表达的抑制作用。4、并进一步深入的探明了其作用机理：(1)、内毒素在转录水平通过抑制白蛋白mRNA的表达来抑制肝细胞白蛋白的合成。(2)、与某种中间蛋白有关，推测可能是细胞因子的介导。(3)、与ERK、p38和NF-κB等信号传导通路的激活有关，进一步阐明了感染时肝脏白蛋白合成下降的分子机理，为研究感染时肝脏急性相反应和低白蛋白血症的治疗探索提供了理论和方法学基础。