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植物热激蛋白90基因在高温胁迫的环境下能诱导转录,且能在短时间内获得大量的表达热激蛋白90(Heat Shock Protein90,HSP90),而HSP90能促进蛋白质的正确折叠和组装,并可以帮助错误折叠的蛋白质重新折叠或降解,以防止受损蛋白的积累,维护细胞内环境的稳定,从而提高机体对逆境的耐受能力。OsHsp82是HSP90基因家族中一类重要成员,其中OsHsp82-2是水稻Hsp82中一个受温度诱导的基因,是研究热激诱导机制的一个理想对象。 本研究以OsHsp82-2为研究对象,利用GUS组织化学检测技术和GFP融合基因瞬时表达技术研究OsHsp82-2的表达模式和亚细胞定位;利用过量表达和RNAi(RNAinterfere)干涉技术分别上调和下调水稻中OsHsp82-2的表达量,观察转化植株的表型变化,揭示其生物学功能;通过扩增及测定不同水稻材料的Hsp82-2序列,对该基因的启动子、ORF(Open Reading Fame)和蛋白质序列进行系统发育分析,初步阐释了OsHsp82-2序列的变异与水稻演化的关系。 本研究所得的结果如下: 1.构建了OsHsp82-2自身启动子融合GUS的表达载体,成功转化后通过GUS组织化学检测研究发现,在热激(37℃)处理下OsHsp82-2的启动子在穗子、茎、根、叶片,叶枕等组织中均能启动GUS基因的转录及表达,但启动时间和持续表达的时间在不同的组织中存在差异,这些结果说明该启动子属于短期的诱导型启动子,且不同器官具有不同的热激应答反应机理。 2.构建OsHsp82-2基因融合GFP的瞬时表达载体,转化水稻原生质体后观察发现OsHSP82-2定位于细胞质。 3.构建OsHsp82-2的过表达和RNAi载体转化水稻,分别获得阳性转化后代,表型分析显示,过表达和RNAi植株均表现出株高变矮和穗长变短的现象,这说明维持OsHsp82-2的表达量对水稻发育非常重要。 4.以33℃和14℃分别处理过表达和RNAi表达转化植株14 d,表型观察显示不论高温或低温处理,过表达植株的长势优于RNAi植株,且过表达植株在高温下的长势明显优于低温,证明OsHsp82-2与水稻的抗逆性相关,并可能在抵御高温中起主要作用。 5.系统发育学分析结果显示,可将63份水稻材料基本分成两大组,其中野生型水稻覆盖了2个组,但主要包含在A组,且近90%的A组水稻材料属于热带或亚热带材料。而栽培水稻全部集中在一个类群内,即B组,且大部分属于温带材料。这说明从野生型到栽培型的进化过程中水稻基因型逐渐趋向单一,显示了野生型与栽培型,热带亚热带类型与温带类型之间逐步演化的关系。 6.为了阐明OsHsp82-2的表达量随时间的变化情况,根据系统发育分析的结果,选取6个有代表性的水稻材料(中花11、Y4、R52、R353、S19和YUN2014)进行热激处理后,提取它们的幼叶RNA进行RT-PCR和荧光实时定量PCR检测。结果发现中花11和R52中的OsHsp82-2对于热激的响应最剧烈;YUN2014,S19和R353中OsHsp82-2的表达量随时间的变化曲线比较平缓;而Y4几乎没有变化。这说明不同水稻的热激响应机制有差异。 本研究证明OsHsp82-2受热激诱导表达,在植物耐热机制中起着重要的作用。不同水稻材料及不同组织的OsHsp82-2受高温诱导的机制差异与基因序列的变异密切相关。此外,OsHsp82-2基因序列的变异与水稻的演化及生长环境有密切的关系。