论文部分内容阅读
目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)抑制人鼻咽癌CNE2细胞增殖和诱导凋亡作用,探讨细胞内游离钙(free calcium, Ca2+)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)、Bcl-2、Bax以及Caspase 3的变化在DADS诱导CNE2细胞凋亡中的作用机制。方法:采用形态学观察、MTT法、流式细胞术和DNA琼脂糖凝胶电泳等方法,观察DADS对体外培养的CNE2细胞生长抑制、诱导凋亡作用以及细胞内Ca2+、ROS的变化。免疫细胞化学及Western blot检测Bcl-2、Bax和Caspase 3蛋白的表达。结果:形态学观察发现,DADS处理CNE2细胞24h后,部分细胞变圆,体积明显缩小,胞质强嗜酸性,核固缩、深染,核染色质积聚至核膜周边,呈现凋亡细胞形态学改变。MTT结果显示,50、100、200、400μmol·L-1 DADS作用CNE2细胞48h后,抑制率分别为3.66%、14.25%、29.66%和61.28%,呈现浓度依赖性关系(P<0.05)。流式细胞术分析显示,50、100、200、400μmol·L-1 DADS作用CNE2细胞24h,凋亡率分别为10.8±1.3%、14.8±1.1%、21.7±2.0%及30.8±2.6%,呈浓度依赖性诱导CNE2细胞凋亡(P<0.05)。200及400μmol·L-1 DADS分别作用CNE2细胞24h后,DNA凝胶电泳出现典型梯形条带。免疫细胞化学及灰度扫描分析显示,200μmol·L-1DADS作用CNE2细胞24h后,Bcl-2蛋白表达明显减弱,平均光密度值由5.22±0.74下降至1.07±0.08;Bax蛋白表达明显增强,平均光密度值由0.81±0.07上升至4.05±0.63;Caspase 3蛋白表达明显增强,平均光密度值由0.77±0.07上升至4.23±0.72;三种蛋白表达差异均有显著性(P<0.01)。50、100、200、400μmol·L-1 DADS处理CNE2细胞24后,Western blot检测及灰度扫描显示, Bcl-2蛋白与β-Actin灰度值比分别为1.92±0.21、1.21±0.18、0.89±0.14及0.41±0.09,与对照组2.24±0.26比较,差异有显著性(P<0.05);Bax蛋白与β-Actin灰度值比分别是0.78±0.14、1.12±0.19、1.54±0.22及2.08±0.27,明显高于对照组0.33±0.08(P<0.05);caspase 3蛋白与β-Actin灰度值比分别是0.33±0.11、0.72±0.15、1.39±0.21及2.28±0.29,较对照组0.14±0.06显著升高(P<0.05)。表明随DADS浓度的增加,可使CNE2细胞Bcl-2蛋白表达下调, Bax蛋白表达上调,导致Bcl-2/Bax比值下降, caspase 3蛋白的活化。细胞内钙离子鳌合剂BAPTA-AM 10μmol·L-1、抗氧化剂NAC 10mmol·L-1、预处理细胞1h,再加200μmol·L-1的DADS处理24h后,凋亡率分别为10.5±0.8%、11.9±1.4%,比单用200μmol·L-1的DADS组显著下降,提示二者具有抑制DADS诱导凋亡的作用(P<0.01)。50、100、200、400μmol·L-1 DADS处理CNE2细胞4h,Fluo3荧光强度分别为4.10±0.20、7.37±0.25、9.73±0.15和12.63±0.45,各处理组均高于对照组1.67±0.21(P<0.05),表明DADS呈浓度依赖性促进细胞内Ca2+水平升高。NAC加DADS组荧光强度为9.63±0.38,与单用DADS组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。50、100、200、400μmol·L-1 DADS处理细胞5h,DCFH-DA荧光强度分别为18.70±2.43、33.23±1.53、41.53±0.78和60.90±1.97,各处理组均明显高于对照组8.27±1.37 (P<0.05)。BAPTA-AM加DADS组荧光强度为26.80±2.69,与单用DADS组比较,差异有显著性(P<0.05),表明DADS呈浓度依赖促进细胞内ROS水平的升高,细胞内钙离子鳌合剂能抑制细胞内ROS水平的升高。结论:1.DADS可抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖并诱导其凋亡。2.DADS诱导CNE2细胞凋亡与Bcl-2/Bax比值下降,caspase 3活化有关。3.DADS诱导CNE2细胞凋亡与细胞内Ca2+水平升高,ROS产生增加相关。4.Ca2+信号通路介导了DADS诱导CNE2细胞凋亡。