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角膜移植是众多器官和组织移植中成功率最高的，然而移植后的免疫排斥反应是角膜移植术后最严重的并发症，也是导致角膜移植术失败的主要原因。其临床表现多样，主要有上皮排斥线、上皮水肿粗糙、Bowman层下白色沉积物、植片基质层水肿浸润、房水闪辉、角膜后尘状沉着物、内皮排斥线等等。角膜移植的成功率与角膜的血管化、植片大小、眼前段炎症、眼前段手术、HLA组织配型等等有关，例如无血管的角膜，排斥反应的发生率约为9％～12％，但在高度血管化的角膜，发生率高达70％以上。
最近，随着对角膜移植排斥反应研究的日渐深入，新的药物及治疗方法不断涌现。除了经典的皮质类固醇外，新近在临床上应用的药物还有环孢霉素A(CsA)及FK506，CsA能选择性抑制辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(CTL)，而促进抑制性T细胞(Ts)，但其分子量大，且为疏水性，眼内通透性差，影响CsA局部用药的疗效。FK506的作用强度约是CsA的10～100倍，且细胞毒性小，但由于其价格昂贵，使其在临床上的长期应用难以普及。除此之外还有雷帕霉素、FTY720、抗干扰素、抗CD4+/CD8+细胞单克隆抗体、IL-1受体拮抗剂、TGF—β和IL—2毒素等药物均可降低角膜移植术后的免疫应答水平，延缓或阻止发生免疫排斥反应，增加植片的透明度和存活时间。
纤溶酶原Kringle5是纤溶酶原中与血管抑素相连的一个联环结构域，由80个氨基酸残基组成，分子量为16KD，它能抑制内皮细胞的增殖、迁移，并能诱导内皮细胞凋亡和细胞周期停滞，具有很强的抑制血管生成活性，已有研究表明Kringle5能有效抑制角膜碱烧伤后新生血管的形成和低氧环境下视网膜新生血管的形成，并对某些实体型肿瘤的生长具有抑制作用。但有研究发现Kringle结构阻碍了K5中某些功能性基团与内皮细胞的有效作用，用还原剂和烷化剂打断K5中二硫键，可以减轻这种掩盖效应，充分暴露有效基团。有研究表明这种经过构建的纤溶酶原Kringle5突变体(mutant1)具有更强的抑制新生血管的作用。
本研究拟通过制备大鼠角膜移植模型，并将Kringle5 mut1滴眼液应用于实验性角膜移植术后，观察其抑制免疫排斥反应的疗效，并探讨其机制，从而为其临床推广使用提供理论依据。
第一部分动物模型的制备及Kringle5 mut1滴眼液的疗效观察
目的：制备大鼠角膜移植免疫排斥反应动物模型，观察Kringle5 mut1滴眼液治疗角膜移植免疫排斥反应效果，并探讨其最佳治疗浓度。
方法：以F344大鼠为供体，Lewis大鼠为受体建立角膜移植排斥反应模型，采用完全随机分组设计方案将实验动物分为5组，A组为F344鼠自体原位角膜移植，B、C、D、E组为F344-Lewis鼠之间进行同种异体角膜移植。术后即一日四次点眼药水，A组和B组滴载体溶液，C组和D组给予的Kringle5 mut1滴眼液浓度分别为5mg/L和10mg/L，E组给予0.1％地塞米松滴眼液，共14天。根据Holland排斥反应评分标准，判断术后植片排斥情况。比较各组角膜植片的平均存活时间，并观察角膜新生血管生长情况，计算其面积。术后14天，对各组角膜植片做组织病理学检查。
结果：C、D组发生排斥反应的时间较B组明显延迟，B组植片平均存活时间(MST)为(9.3±2.1)d，C、D组MST分别为(21.1±7.3)d和(23.5±10.8)d，它们分别与B组比较，差异有统计学意义(p<0.05)。E组植片存活情况较C、D组好，但组间比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。术后A、B、C、D、E组角膜新生血管开始出现的时间分别为(3.1±0.8)d、(2.6±0.5)d、(6.4±0.5)d、(7.8±0.7)d、(5.3±1)d，其中C、D、E组较A、B组明显延长(P<0.05)，C、D及E组两两组间比较也有统计学意义(P<0.05)，D组出现NV最晚。术后各时间点C及D组角膜新生血管的生长面积明显较B组少(P<0.05)，并且与E组比较差异有统计学意义(P<0.05)。角膜植片病理学检查，B组可见大量炎性细胞浸润及角膜新生血管形成，而C组机D组植片炎症发应较轻，基本无新生血管形成。
结论：两种浓度Kringle5 mut1滴眼液都能够延缓大鼠角膜移植排斥反应的发生，并能够抑制术后新生血管的生成，其中10mg/L浓度组治疗效果较佳。
第二部分Kringle5 mut1滴眼液及联合地塞米松滴眼液治疗角膜移植排斥反应的研究
目的：观察10mg/L浓度的Kringle5 mut1滴眼液及联合0.1％地塞米松滴眼液治疗角膜移植免疫排斥反应效果，并探讨其抑制机制。
方法：以F344大鼠为供体，Lewis大鼠为受体建立角膜移植排斥反应模型，采用完全随机分组设计方案将实验动物分为4组(A、B、C、D组)，术后即一日四次点眼药水，A组滴载体溶液，B组和C组分别给予10mg/L的Kringle5 mut1滴眼液和0.1％地塞米松滴眼液，D组为10mg/L的Kringle5 mut1滴眼液+0.1％地塞米松滴眼液联合用药组，共滴14天。实验观察期间对各组大鼠角膜植片存活情况、透明性、基质水肿情况、新生血管的生长进行比较。并于术后不同时间点(3d、7d、10d、14d)取下角膜，HE染色观察各组角膜组织病理变化。并运用免疫组织化学方法和ELISA法检测和比较各时间点各组间肿瘤坏死因子—α(Tumor necrosis factor—α，TNF—α)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达水平和部位。
结果：B、C、D组发生排斥反应的时间较A组明显延迟，A组植片平均存活时间(MST)为(9.3±2.1)d.B、C、D组MST分别为(23.5±10.8)d、(28.2±19.1)d和(39.8±16.5)d，它们分别与A组比较，差异有统计学意义(p<0.05)。D组植片存活情况较B、C组好，其差异有统计学意义(P<0.05)。术后A、B、C、D组角膜新生血管开始出现的时间分别为(2.6±0.5)d、(7.8±0.7)d、(5.3±1)d和(8.2±1.1)d，其中B、C、D组较A组明显延长(P<0.05)，B、D组与C组比较均有统计学意义(P<0.05)。角膜植片病理学检查，A组可见大量炎性细胞浸润及角膜新生血管形成，而B组、D组植片炎症发应较轻，基本无新生血管形成，其中D组最显著。免疫组织化学显示B、C、D组的TNF—α和VEGF表达水平较A组低，其中D组最低。ELISA法显示植片中TNF—α、VEGF的表达总体上是逐渐降低的。B、C、D组的TNF—α和VEGF含量与A组比较均有统计学差异(P<0.05)，并且C组的VEGF含量与B、D组比较有意义(P<0.05)。
结论：K5 mut1滴眼液及联合用药均能减轻角膜移植术后炎症细胞浸润、炎性因子的表达和抑制新生血管形成，其中联合用药的降低免疫排斥反应的效果优于单一用药。